高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定精选.pdf

第33 卷 第7 期 中 国 预 防 兽 医 学 报 Vol. 33 ，No.7 2011 年 7 月 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Jul. 2011 doi: 10.3969/j.issn.1008-0589.2011.07.01 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4 株 感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定 张善瑞，周艳君，朱建平，童 武，姜一峰，童光志* ( 中国农业科学院上海兽医研究所/ 猪传染病研究室，上海 200241) 摘 要：为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆，本实验根据PRRSV HuN4 株基因组 序列设计并合成PRRSV 特异性引物，应用RT-PCR 技术分6 段扩增了PRRSV HuN4 株全基因组cDNA 。将扩增 的各个cDNA 部分重叠片段分别克隆于pBlueScript ⅡSK (+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4 。并在病毒 cDNA 5 末端引入sp6 启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本，在3 末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切 位点用于线性化pHuN4 ；此外，将HuN4 基因组第 14 680 位的A 沉默突变为G 产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴 定拯救病毒的分子标记。pHuN4 通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK 细胞，并在Marc-145 细胞中救获病 毒。结果显示：救获的病毒能够在Marc145 细胞引起明显的细胞病变；间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果 表明病毒拯救成功，而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异。利用拯救的第5 代克隆病毒株对本动物 进行致病性试验，结果显示实验猪在感染后第3 d 开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现，发病率达100 %， 在感染后20 d 内陆续死亡，表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征，以上研究证实我们成功的 构建并获得PRRSV 强毒HuN4 株感染性克隆，为从基因水平上研究PRRSV 的致病机制提供了技术平台。 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；HuN4 株；感染性分子克隆 中图分类号：S852.65 文献标识码：A 文章编号：1008-0589(2011)07-0497-06 Generation of a infectious cDNA clone of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus HuN4 ZHANG Shan-rui, ZHOU Yan-jun, ZHU Jian-ping, TONG Wu, JIANG Yi-feng, TONG Guang-zhi* (Division of Swine Infectious Diseases, Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China) Abstract : In this study, a infectious cDNA clone of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) strain HuN4 was generated by cloning of the 6 overlapped RT-PCR fragments into pBlueScript ⅡSK(+), designated pHuN4. In addition, sp6 promoter at 5-terminus an