ABI3100简介及其常见问题解析PPT.ppt

ABI3100简介 及 其常见问题解析;主要内容;;310遗传分析仪;3100和 3100Avant基因分析仪;3730 和 3730xl 基因分析仪;型号;二.ABI 3100构造及毛细管工作原理 ;1.结构图;;此图表示的是：气泡没有排出通道。 ; 注意96孔板的使用。3100是16道的，每个run 使用两排孔。若是4道的则是每个run 4孔，注意与样品名的对应。 310 是单道的毛细管，不能使用96孔板，而是使用0.5ml 的离心管上样。;阳极有电极插在buffer中; 电渗流：pH大于6时，石英带负电荷，熔融的石英毛细管内层带负电，来自毛细管内的溶液的正电荷产生电渗流，沿负电荷的毛细管壁形成双层，在电场作用下，双层中的阳离子向阴极移动，带动可溶分子向同一方向移动。 为保证DNA片段分离的重复性，必须包埋毛细管内壁以除去电渗流，ABI3100采用能进行DNA分离的POP-4或POP-6胶线性包埋毛细管内壁，阻止电渗流，使DNA从阴极到阳极没有液体的流动。毛细管的包埋使之随着时间而性能有所降低，影响使用寿命。;检测： 一束激光被分成两束从毛细管的两侧同时照亮16根毛细管，当DNA片段经过检测室时，所带荧光染料被激发，荧光被检测到，形成胶图。 ;;三.数据收集软件的简介 1.开关机器 顺序：电脑，3100机器，收集软件（关机相反） ;;2.空间校正 空间校正表明在CCD上呈现每一根毛细管发出荧光的正确位置，而不反应毛细管的任何信息。 更换毛细管，毛细管的被拆卸安装后时要进行空间校正。;;3.光谱校正 是为了校正荧光染料发射光谱的重叠，可以消除不同荧光染料间的相互影响。以下情况必需做校正：机器使用了新的dye set，激光器或CCD更换，结果不好有 pull up，pull down的峰。;进行光谱校正遵循以下步骤 新建Pvrotocol;新建plate;注意：进行光谱校正时应注意，4道的毛细管和16道甚至更多道的毛细管在检测灵敏度上明显不同，毛细管少灵敏度会明显高一些，这里忽略毛细管使用次数的影响。;校正不好的实例：;（2） ;2. 软件提示：Saturated data detected. Calibration failed. 表现：;3. 软件提示：Bad dye order detected. 表现：;4. 软件提示：Failed quality check: q=0.93807 is less than minQ threshold (0.95000) 表现：;4.检测样品 目前检测样品是marker0.2μl ，上样量1.0μl，总体积10μl 样品的准备：甲酰胺与marker 混合均匀分装，加入样品后振荡， 离心，95℃变性5min，冰浴3min， 离心，上样。;;;;5.结果的存储 先在“我的电脑”的E盘上建一个文件夹用于储存结果，在数据收集软件中有 可以进行设定。;;;结果的重新导出： 结果可以重新导出，或将所需要的部分结果重新导出到指定文件夹。;6.手动控制;四.数据分析软件的简介;;;;2.分析数据 添加要分析的文件夹：;panel;Analysis method;分析后如果如下图所示：不通过，查找原因。;查看原始数据：;查看内标：;结果所得图形：;分析工具栏：;;;;;;;5. 基线不平，峰形明显异常 原因：胶中可能有污染物（清洗block，syring，更换胶） 胶中有结晶或沉淀物（将胶在室温放置30min使之达到室温，旋 动使沉淀物溶解） 光谱校正的不好;6.信号凌乱，有倒峰 原因：所选的dye set不适合 光谱校正的不好;7.无电流或电流异常 原因：使用的水质量不好（更换超纯水） buffer槽中是水或 buffer稀释的倍数不对 阳极没有足够的buffer block或毛细管中有气泡（排气泡） 胶已失效 整个体系中有泄漏的地方 ;;10. 有一根毛细管电泳时背景有荧光，导致基线不平，影响结果。;11. 每次电泳时并不是全部泳道信号都很好 信号弱或无信号的泳道主要集中在两端;12. 泳道中间基线明显形成一个台阶;13. 电泳导致大片段峰形变宽;;15. 电泳时出现目的片断以外的其他杂峰;16.出现电泳