产纤维素酶菌株的筛选.docVIP

1 引言 目前，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，在世界范围内有效地开发和利用生物资源已成为应对资源枯竭和能源短缺的主要手段，其中利用纤维素酶制取生物产品、生物能源物质、生物燃料等是解决能源问题和降低成本的主要途径之一[1]。纤维素作为地球上最古老、最丰富的天然高分子物质，是自然界中分布最广、含量最丰富的多糖，是人类宝贵的可再生天然资源[2]。 纤维素酶在食品、饲料、纺织、造纸、制药、能源和环保方面有着重要应用价值。纤维素在纤维素酶的作用下被分解成小分子可被利用的葡萄糖，用于食品、饲料生产，还能作为生产乙醇的原料，纤维素被分解后形成的L-乳酸，可用于生产可降解塑料，减少“白色污染”[3]。 纤维素酶的来源非常广泛，广泛存在于自然界的生物体中。可以产生纤维素酶的生物体非常多，主要有昆虫、细菌、放线菌、真菌等。其中，细菌和放线菌的产酶量非常低，且都是胞内酶，大多数酶对结晶纤维素不具活性，因此对其研究比较少[4]。目前，较多应用于生产纤维素酶的微生物为丝状真菌，其中木霉、曲霉、根霉和青霉是酶活力较强的菌种，而里斯木霉、康氏木霉、绿色木霉等比较典型，是目前为止公认的比较好的纤维素酶生产菌。现在，绿色木霉、镰刀霉、黑曲霉以及斜卧青霉和拟青霉等的纤维素酶已制成制剂[5]。目前很多研究说明很多真菌、细菌和放线菌都能产生纤维素酶。因此，分离筛选出高效生产纤维素酶的菌种具有重要的研究价值。 而本试验研究的是试验室保藏的12种分别来自鸡、猪、羊、兔、牛肠道中的益生菌株，通过测定其羧甲基纤维素酶活力，以期获得产纤维素酶能力较强的菌株。 2 材料与方法 2.1 试验材料和主要仪器 2.1.1菌株 供试菌株：Y5-22、J-2、N-14、TU-1-15、J-42、J-10、J-35、J-11、Z-27、J-4、N-10、Y5-39 2.1.2培养基 NB培养基：蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、蒸馏水、pH7.2～7.4、121℃、20min高压蒸汽灭菌。 纤维素刚果红培养基：(NH4)2SO4:2g、MgSO4?7H2O:0.5g、KH2PO4:1g、NaCl:0.5g、CMC-Na:2.0g、刚果红:0.4g、琼脂:20g、水:1000mL、Ph:自然。 复筛培养基：CMC-Na:10g、(NH4)2SO4: 4g、KH2PO4:2g、MgSO4?7H2O:0.5g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、水1000mL。 2.1.3试剂 (NH4)2SO4、MgSO4?7H2O、KH2PO4、NaCl、CMC-Na、刚果红、琼脂、蛋白胨、牛肉膏、柠檬酸钠、柠檬酸、氢氧化钠、葡萄糖、3, 5—二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、苯酚亚硫酸钠。 2.1.4试验器具 电子天平、药匙、电热炉、酒精灯、竹签、培养皿、试管、恒温培养箱、摇床、超净工作台、容量瓶、锥形瓶、移液枪、PH试纸、高压蒸汽灭菌锅、量筒。 2.1.5试剂的配制 pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液：称取醋酸钠6.7g和冰醋酸2.60mL，用蒸馏水溶解定容至2000mL。 DNS显色液：取10g重结晶的DNS，溶于蒸馏水中，加入20g氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500mL加热溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g，加热搅拌全部溶解后，冷却，定容至1000mL，放置一周过滤备用。 0.5%CMC：称取CMC5g，以pH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液加热溶解，呈细小颗粒胶状，冷却，用缓冲液定容至1000mL，置冰箱中备用。 2.2.1 供试菌株的初筛 将纤维素刚果红培养基在微波炉内融化后，置于超净台内，使培养基温度降至大约40℃左右，倒入灭好菌的平皿内。将斜面保存菌株用灭菌竹签挑出，划“+”字于平皿上，每个平皿内划六株菌。于平皿背面相对应位置注明菌号。放置于37℃生化培养箱中培养24h后，观察平皿中出现水解圈情况，将出现水解圈的菌株选出，进行编号。 2.2.2供试菌株的复筛 用250mL锥形瓶，装入50mL摇瓶产酶培养基，将斜面保存菌种接种于培养基中，37℃摇床培养24h，做待测菌液。 将纤维素刚果红培养基在微波炉内融化后，置于超净台内，使培养基温度降至大约40℃左右，倒入灭好菌的平皿内.待琼脂凝固后用打孔器在培养基上等距离打孔6个，直径为4mm，每个孔内加入50uL菌液。每个菌种做3个平行。置于37℃生化培养箱中培养24h后，测量水解圈直径，求出3个平行的平均值。 2.2.3测定CMC酶活力 2.2.3.1纤维素酶的测定原理 纤维素酶水解纤维素生成还原糖，还原糖又同3，5-二硝基水杨酸发生反应，呈现黄橙混合色，用分光光度计测定其OD值，计算酶活力。 纤维素酶活力单位（Cx）：1g酶粉或1mL酶液在50pH4.6条件下，以水解反应中每分钟催化羧甲基纤维素钠水解形成为葡萄糖的微克数为1个单位，以μ / g表示。