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PCR常见问题、原因分析及其对策 北京天为时代科技有限公司 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性 PCR常见问题之一 无扩增产物 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 原因 对 策 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 现象：正对照有条带，而样品则无； PCR常见问题之二 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。 PCR常见问题之三 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 PCR常见问题之三 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 PCR常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 提高PCR反应特异性的策略 巢式PCR（Nest-PCR） 四种策略 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂 策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。 策略之二 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。 策略之三 热启动PCR （HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度； 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。 策略之四 使用PCR增强剂 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当 谢谢！ 北京天为时代科技有限公司 http// 免费咨询：800－810－2177 石家庄总代： 石家庄拜昂生物技术有限公司 联系电话：0311－6671128 6052086