痢疾志贺氏菌免疫pcr试剂盒说明书.pdfVIP

上海慧耘生物科技有限公司 痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)免疫PCR 试剂盒 标准依据 GBT 4789.5-2012：《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 志贺氏菌检验》 包装规格 20T/盒 检测原理 本试剂盒将痢疾志贺氏菌单克隆抗体包被在经过特殊处理的PCR 管壁，在加入待测样品后，管壁上的 抗体会特异性的捕捉并富集样品中的痢疾志贺氏菌，之后直接在PCR 管进行PCR，预变性过程中痢疾志贺氏 菌裂解释放DNA 作为模板，直接进行PCR 扩增，最后用琼脂糖电泳检测电泳产物，以判定样品中是否有痢 疾志贺氏菌。 检测流程 检测样品前处理 1、食品样品的直接检测：样品处理参考国标GB/T 4789.5-2012 进行。以无菌操作取检样25g （mL），加入 装有灭菌225mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min～10 000 r/min 均质； 或加入装有225mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1 min～2 min，液体样品振荡 混匀即可。于41.5 ℃±１℃，厌氧培养16 h～20 h。 2、疑似菌落检测：直接用接种环或者无菌TIP 头挑去肉眼可见的菌团，配成1×、10×两个梯度稀释液， 分别在PCR 管中按照以下步骤扩增。 操作流程 1．免疫捕获 1．1 加样：若是增菌液吸取200ul 加入免疫PCR 管中；若是平板上的菌落则取两个梯度稀释液各200ul， 加入PCR 管，37℃温箱孵育2h，取阳性和阴性对照样品作为对照。 1．2 洗涤：加PBST200ul，洗涤三次去除杂菌、样品中的其它蛋白、杂质等，每次洗涤PCR 管的时候，PCR 管需在滤纸上扣干净，保证不残留肉眼可见的水分。 注意事项： 1.以上操作尽量在超净台完成，每次使用超净台之前必需紫外灭菌； 2.加样步骤若采用37℃+摇床，效果更佳； 上海慧耘生物科技有限公司 3.每一步骤的操作最好做到 “完成一个PCR 管立即盖上盖子”，因为PCR 反应很灵敏，若有操作失误造成 污染，会严重影响检测结果； 4.操作中可将PCR 管架在空的酶联板上，以保证PCR 管内的液体保持水平； 5.洗涤时尽量避免重复使用滤纸，尤其是在 “步骤1.2”中，因为叩出的菌液会残留在滤纸上，若重复使用 会导致交叉污染。 2．PCR 操作程序 2．1 反应体系为：50ul 的体系 10*Buffer 5ul 2+ Mg 3ul dNTP 2ul TaqDNA 聚合酶 1ul Primer Ⅰ 2ul Primer Ⅱ 2ul 灭菌的ddH2O 35ul 每份总体积 50 µL，含 49µLPCR 反应液，1µL 酶混合液， 例如：n 份样品，配制 n+1 份，50×(n+1) PCR反应液，各取 50µL 加入到 “步骤1”中免疫捕获的PCR 管 中，作好标记。 2．2 扩增条件 在 PCR 扩增仪上进行以下循环： 95℃预变性20min，95℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35 个循环，72℃延伸5min，4℃保存反 应产物。 3．电泳 称取0.6g 琼脂糖放于 100mL锥形瓶中，加入 1倍稀释的 TAE 电泳缓冲液40mL(取 0.8mL50 倍 TAE 电泳缓 冲液，用双蒸水稀释至 40 mL)，用微波炉中将琼脂糖熔解，然后再加入 10 µL 染色液混匀。在电泳槽内放 好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将 PCR 扩增产物 10 µL 混合 2µL 上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中， 以 80～100V 电压于1 倍的 TAE 电泳缓冲液中电泳，紫外灯下观察结果。 4．结果判定 4．1 阳性对照样品出现 629bp 扩增条带、阴性对照样品无条带出现(引物带除外)时，实验结果成立。 上海慧耘生物科技有限公司 4．2 被检样品若出现 629bp 扩增带，则为痢疾志贺氏菌阳性，否则为阴性。 上海慧耘生物科