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高产纤维素酶菌种的筛选鉴定与发酵产酶优化 PAGE VI 硕 士 学 位 论 文 高产纤维素酶菌种的筛选鉴定与发酵产酶优化 Screening, characterization of efficient cellulase producer and optimization of cellulase production 作 者 姓 名： 孙 鸿 金 学科、 专业： 生物工程 学 号： 指 导 教 师： 赵心清 副教授 完 成 日 期： 2011年11月 大连理工大学 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目： 作 者 签 名 ： 日期： 年 大连理工大学硕士学位论文 PAGE VII - - 摘 要 纤维素酶在食品、饲料及生物能源生产等多个领域都有重要应用，因此其生产菌的开发和发酵生产受到各国学者的重视。本论文从山西玉米秸秆堆积处土壤和大连海泥样品中分离得到10株具有纤维素水解活性的丝状真菌和放线菌，其中一株木霉菌M20活性最好，ITS序列分析结果表明，该菌种与绿色木霉（Trichoderma viride）很相近，ITS序列最大相似度为97%。M20的产酶培养基发酵液具有降解纤维素的能力，对滤纸、羧甲基纤维素钠等纤维素的水解能力较强，也可以降解玉米秸秆、草坪草、落叶、菊芋秸秆等木质纤维素原料。进一步研究了所产纤维素酶的酶学性质，并优化了M20的产纤维素酶条件，主要实验结果如下： M20摇瓶发酵产纤维素酶的最佳诱导物为微晶纤维素，最佳添加量为0.5%。替代氨基酸的最佳氮源为蛋白胨，当初始pH为6，培养温度为28℃，发酵培养第7天时，滤纸酶活力（FPA）可以达到9.2 IU/ml。通过正交设计软件设计培养基组分添加量方案，滤纸酶活力（FPA）最优结果可以达到9.89 IU/ml，比对照提高了12%。M20所产纤维素酶在低温条件下保存2周酶活性变化不明显，但对60℃以上的高温较为敏感，其最佳酶反应条件是：温度50℃，pH为4.8。 利用5L发酵罐培养M20进行发酵产酶实验，结果表明，产纤维素酶的酶活在第6天达到最高值，FPA可以达到8 IU/ml左右。调控pH先为4.8，生长2.5天以后，调控pH为6，并且在第三天一次性加入终浓度为5g/L的微晶纤维素，在发酵第5天FPA可以达到8 IU/ml，达到最高酶活时间提前了一天。 用M20的发酵液可以水解不同的木质纤维素原料，利用HPLC测定还原糖其释放含量，结果表明，玉米秸秆释放的葡萄糖与木糖含量最多，草坪草释放的葡萄糖含量比菊芋秸秆多，而落叶最少，从水解释放的木糖含量来看，菊芋秸秆要多于落叶，而草坪草最少。这些结果表明，M20的发酵液可以水解不同来源的木质纤维素原料。 关键词：绿色木霉菌；纤维素酶；滤纸酶活力；发酵优化；木质纤维素；还原糖 Screening, characterization of efficient cellulase producer and optimization of cellulase production Abstract Cellulosic enzymes have important applications in various fields including food processing; feed industry and biofuel production, therefore, development of efficient producer strains and cellulase production have attracted the attention of researchers worldwide. In this study, filamentous fungi and