动物细胞工程制药-3.pptVIP

动物细胞工程制药 第七节 动物细胞生物反应器 生物反应器必备条件 制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基、细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的 生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能 密封性能良好，可避免一切外来的不需要的微生物的污染 设备成本尽可能低 对培养环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精确度高，而且能保持环境质量的均一 可长期连续运转 容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积 拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修 一、生物反应器的类型及其基本结构 搅拌罐式生物反应器 气升式生物反应器 透析袋或膜式生物反应器 中空纤维生物反应器 固定床或流化床式生物反应器 二、生物反应器的检测控制系统 培养过程中需检测的物化参数：温度、pH、搅拌速度、溶氧；活细胞数，氨基酸浓度分析、葡萄糖、乳酸和氨离子的测定；细胞的群体倍增时间、细胞的比增长率、葡萄糖消耗率、乳酸产率、生物反应器生产率等 主要参数的检测和控制方法：在线经传感器检出，取样离线检测 第八节 动物细胞产品的纯化方法和质量要求 下游纯化工作费钱、难度大 工程细胞表达的产品，常常和细胞内容物、培养基成分，特别当采用有血清培养基时小牛血清中的各种蛋白成分都将与产物混杂在一起，这些成分的物化性质常常和目的产物非常相似，因此很难将它们分离开 由于产品多数用于人体，为防杂质对人体的有害作用，对产品的纯度要求很高 大多数动物细胞表达的产物产量低、生物活性很不稳定，因此要求纯化过程中所有的操作都应该非常温和、精细，包括溶液的温度、pH和盐离子强度等都需要严格控制，要有相当精密的设备和检测仪器 由于细胞产品多种多样，它们的氨基酸组成、结构、相对分子质量大小和等电点等都不尽相同，因此分离纯化技术的通用性差，必须根据每一种产品的特点研究开发出适合于该产品的专用的分离纯化技术 一、动物细胞产品常用的纯化方法 离心、超滤、透析 酸处理、盐析或有机溶剂沉淀 凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、高压液相色谱 二、动物细胞产品的质量要求 对工程细胞的要求： 有细胞系的历史资料 有细胞特性的资料 无细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括反转录病毒等外来有害因子的污染 生产工艺（细胞培养和纯化工艺）的要求 对生产厂房、原材料和试剂的要求 对细胞培养的要求 对纯化过程的要求 对产品的质量要求：产品纯度、产品生物活性、产品比活性，产品蛋白质性质的鉴定，产品中杂质的检测，产品的稳定性，产品临床前的安全性和有效性评价，产品临床试验的安全性和有效性评价 第九节 动物细胞制药的前景与展望 一、改进表达载体，提高表达水平和产量 采用更强的启动子和增强子 更好地利用扩增系统或寻找高表达位点 采用和改造更好的宿主细胞 二、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 采用代谢工程改造工程细胞 代谢工程（metabolic engineering），即采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其降低对某些营养物质的需要，减少某些代谢产物的产生和危害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力 改进培养工艺，降低生产成本 优化培养工艺 三、抑制细胞凋亡，延长培养周期 细胞凋亡：一种由遗传基因决定的程序性细胞主动死亡 防止细胞培养过程中细胞凋亡的三种措施：①通过培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；②用化学添加剂如抗氧化剂等阻断细胞凋亡过程；③采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞 Simpson等将TB/C3细胞稳定转染bcl-2后，细胞活力增强，抗体滴度上升 Itoh等发现转染了bcl-2的2E3细胞，其抗体生产能力比未转染细胞提高了4倍 Huang等实验表明，当共表达bag-1和bcl-2基因时，可产生相同的或协同的抗细胞凋亡作用 四、采用糖基化工程，提高产品质量 蛋白质有两种糖基化方式：N-糖基化和O-糖基化。O-糖链对蛋白质特性影响不大，N-糖链的不同对产品可产生较大的影响 决定糖链类型的主要因素：合成肽链的不同、细胞内糖基化酶的不同、细胞培养环境的影响 糖基化工程(glycosylation engineering)，即用基因工程的手段，人为地改变肽链结构、增加某些酶基因以及改进和控制某些培养条件等，以达到正确糖基化的目的 Fusseneger等报道在t-PA基因中进行点突变，改变一个氨基酸，使之增加一个糖基化位点，此时t-PA在血浆中的清除率，较原先的t-PA减少了10多倍 Minch等将t-PA与α-2,6-唾液酸转移酶基因共转染CHO细胞，表达的t-PA糖基化与人类的接近 Lamotte等将γ-干扰素基因与α-2,6-唾液酸转移酶基因共转染CHO细胞，结果γ-干扰素中α-2,6-唾液酸化程度较对照提高