自噬相关蛋白p62及LC3在大鼠急性高眼压模型视网膜中的表达及意义-硕士研究生(眼科学)开题报告宣讲.ppt

学院：第二临床医学院 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 自噬相关蛋白p62及LC3在大鼠急性高眼压模型视网膜中的表达及意义 研究生：郑冰茹 导师：吴瑜瑜教授 立项依据 目录 研究目的、意义 主要内容及创新点 1 2 3 4 5 8 预期结果及可能的问题 实验进展安排 6 预实验结果 立项依据 青光眼是一组以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs)及其轴突数目进行性丢失、视盘凹陷扩大、视野缺失为特征，伴眼压升高的致盲性眼病。 立项依据 青光眼视神经病变的发病机制 立项依据 青光眼视神经病变的发病机制 氧化应激反应 神经营养因子剥夺 谷氨酸兴奋毒性反应 胶质细胞的激活 免疫调控紊乱 视神经轴突的保护 视盘重塑 RGCs的保护 立项依据 免疫调控 自噬在青光眼视神经病变发病机制中的作用 自噬 Autophagy 立项依据 自噬（ Autophagy ）即真核生物通过溶酶体机制降解细胞内组分的过程。细胞通过自噬降解胞内细胞器、微生物、可溶性蛋白及RNA以维持胞内稳态，并提供营养物质及代谢原料。 立项依据 自噬的过程 立项依据 自噬体标记蛋白LC3 定义：微管相关蛋白1 轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3/Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。 分类：①LC3-I蛋白：散在分布在胞浆内 ②LC3-II蛋白：定位于自噬体的内膜和外膜 检测意义：①LC3-II的水平在某种程度上反映了自噬体的数量 ②自噬时表现为LC3-I的减少和LC3-II的增加，通过LC3- II/LC3-I或者LC3-II/(LC3-I+LC3-II)即可反映自噬水平 立项依据 自噬过程的调控 [1] Mónika L, Péter L, The role of the selective adaptor p62 and Ubiquitin-Like proteins in Autophagy 立项依据 p62在青光眼视神经病变中的作用 研究目的及意义 研究目的 检测大鼠急性高眼压模型中RGCs凋亡率并观察其形态变化 检测p62、LC3蛋白在大鼠急性高眼压模型视网膜中的表达情况 探讨p62在大鼠急性高眼压模型视网膜中的作用及机制 探讨自噬过程与大鼠急性高眼压模型视网膜神经节细胞存活的联系 研究目的及意义 研究意义 利用自噬清除细胞内受损细胞器、降解大分子蛋白质及维持细胞稳态的功能，提高视网膜神经节细胞的耐受力 通过研究自噬调节过程，探讨其可能作用机制，为青光眼视神经保护提供新的思路 研究主要内容 研究主要内容 110cm(约88mmHg) 25G（0.55*20mm）的输液针头 0.9%生理盐水 以瓶内的液体不再向眼内滴注、虹膜苍白和视网膜苍白水肿等作为动物眼达到外界给定压强的判断依据，维持高眼压状态60min 优点：操作简单，研究时程短，结果具有较好的可重复性。 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 成年雌性SD大鼠55只 正常对照组 急性高眼压组 建模 24h 48h 12h 1h 0h 免疫组化 Western-blot 细胞免疫荧光 HE染色 TUNEL法 p62、LC3蛋白在视网膜的 定性及定位情况 计算RGCs的数量；检测RGCs的凋亡率 p62、LC3蛋白在视网膜的定量检测 技术路线图 主要创新点 思路创新：以往关于青光眼视神经病变的研究主要集中在视网膜神经节细胞凋亡的信号通路，而本实验从新的角度——自噬探讨其在大鼠急性高眼压模型视网膜神经节细胞的作用 实验设计：自噬是一个随时间不断变化的动态过程。因此，实验设计根据五个不同时间点对实验动物进行分组；并分别从形态学，蛋白质水平出发，更全面分析自噬过程与视网膜神经节细胞之间的关联 预期结果 HE染色：正常对照组可见视网膜各层分布整齐结构清晰，高眼压组初期视网膜呈水肿状态，随着时间延长，各层呈萎缩状态； TUNEL法：高眼压组凋亡率随时间延长而增加； 免疫组化：高眼压组p62、LC3蛋白在视网膜多层中均有表达； Westernblot：高眼压组p62蛋白的表达随着时间先减少，随后增加；LC3蛋白的表达随时间延长先增加，随后减少 问题及解决方案 实验过程 问题 解决方案 造模过程 麻醉不足，动物提前苏醒；麻醉过深，动物致死 严格按量麻醉，正确腹腔注射，缩短操作时间 取材过程 眼球标本的保存 提前准备液氮用以冰冻保存，4%多聚