cDNA文库制备.ppt

cDNA文库制备 ;主要内容;cDNA文库概述; 3）器官特异性 有的结构基因的表达就有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。 4）代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同。;相对于基因组文库而言，cDNA文库有优点;不足之处;寡聚（dT）－纤维素柱层析;二、cDNA的第一链合成;反转录引物;三、cDNA的第二链合成;自身引导法合成cDNA第二链;置换合成法合成cDNA第二链;四、双链cDNA的分级分离;五、cDNA克隆载体; 质粒载体系统可以功能性筛选： （1）文库中cDNA编码序列能在宿主细胞中功能表达，产生具有天然构像的编码产物。 （2）检测出目的功能表型的同时，能直接获得编码这一表型的基因型。 缺点：库容量小，1ug cNDA构建出的cDNA文库 ，原始克隆数只有106以下。;六、双链cDNA与载体连接;同聚物加尾;以λ噬菌体为载体??建cDNA文库;全长cDNA文库;SMART技术构建全长cDNA文库;七、cDNA文库的均一化处理; cDNA文库的筛选;免疫筛选法;酵母双杂交系统;cDNA文库的评价; 2、重组 cDNA 片段的序列完整性: 在细胞中表达出的各种mRNA基本上都是由3部分组成，即5端非翻译区，中间的编码区和3端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。因此，要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组 cDNA片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。;小结