华南农业大学-LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳幻灯片.pptVIP

实验四  LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、实验目的： 1.了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离乳酸脱氢酶同工酶的电泳过程。 二、实验原理 1. 聚丙烯酰胺凝胶原理及影响因素（同实验三） 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（同实验三） 3. 乳酸脱氢酶(LDH)同工酶圆盘电泳 同工酶是指生物体中结构和性质不同而能催化相同反应的一类酶。许多酶都具有同工酶（约占已知酶的40～50%），凝胶电泳可利用同工酶结构上的差异而将之分离。 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase 简称 LDH， EC.1.1.1.27）是催化丙酮酸和乳酸可逆转化的酶。 1959年 Markert 等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称 LDHl ，靠近阴极一端的称为LDH5；其余3种，由阳极到阴极依次命名为LDH2 ，LDH3及LDH4。它们均具有LDH 催化活性，从而首先提出了同工酶(isoenzyme)的概念。 目前已知LDH同工酶是由亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H4（LDHl），H3M（LDH2），H2M2（LDH3），HM3（LDH4）及M4（LDH5）5种。心肌中以LDHl含量高，骨骼肌及肝中LDH5 含量高。 LDH同工酶底物染色显色反应如下： 反应式中PMS为甲硫吩嗪（phenazine methosulfate），NBT为氯化硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium chloride）的缩写，它们都是接受电子的染料。LDH与底物染色液在37℃温浴中脱下的氢最后传递给 NBT生成蓝紫色的 NBTH2称为甲膝，此物不溶于水，有利于显色后区带的保存，但可溶于氯仿及95%乙醇（9∶1）的混合液。因此电泳后的显色区带可通过浸泡法浸出，于560nm比色，也可用光吸收扫描仪得出LDH同工酶间的相对百分含量。 目前，LDH及同工酶检测已广泛用于临床，作为某些疾病鉴别诊断的依据，常用醋酸纤维薄膜电泳，琼脂糖电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳分离 LDH及共同工酶，这3种不同支持物电泳及染色原理完全相同，但灵敏度不同。 三、实验材料、仪器和试剂 (一)实验材料（由老师准备） 兔子血清和组织(肝脏组织、心脏组织、肾脏组织、肌肉组织、肺等)提取液（组织重量与组织匀浆缓冲液体积比为1∶10（g/mL）。 组织样品处理：称取0.5克兔血清和肝脏等组织，各加入5mLPBS和少量石英沙于研钵磨成匀浆，离心10000r/10～15min，取上层清液4 ℃保存作为母液。 电泳样品：用移液枪各取1mL上述提取液，加1mL40%蔗糖溶液和20uL溴酚兰，混匀。 (二) 仪器及器皿 1 全班共用： 圆盘电泳槽 直流稳压电电泳仪 恒温水浴锅 微量加样器 移样器 电炉等 电泳槽3个(12个管/个)，电泳仪3个，200mL烧杯10个，100mL容量瓶5个，1000mL容量瓶1个(或1000mL量筒1个)，广泛pH试纸，塑料大烧杯（2L）2个, 塑料大烧杯（L）1个，剪细滤纸条1杯。 2 每组配备 长滴管1支，玻管及乳胶管（带玻珠）2个，长针头注射器1支，试管2支，洗耳球1个，10 mL离心管2个，玻棒。 (三)、试剂 1 制备样品有关试剂（老师配） （1）0.01mo1／L pH 6.5磷酸盐缓冲液（PBS），用于组织匀浆缓冲液及LDH的染色液 Na2HPO4·12H2O 0.2256g ，NaH2PO4·H2O 0.2137g，加水定容到200mL。 （2）40%蔗糖溶液 20g蔗糖用水溶解定容至50mL。 （3）0.5％溴酚兰 10mL 四 操作步骤 1．凝胶柱的制备(每人做1条胶，玻璃管体积2mL，胶量1.5mL) 将凝胶贮备液A、B及水按1：2：1的比例混合于烧杯中，另量取4份的C液于另一烧杯中[注意：每6人配制如下： 1个烧杯配A：B：水＝1(3 mL)：2(6 mL):1(3 mL) 另一烧杯配C液4份(12 mL) 当准备好带有玻珠乳胶管封底的玻璃管后，可把两烧杯中的溶液混合，轻搅均匀，用长滴管沿玻管壁小心加到玻管中。胶液应灌到离管口约5～8mm处。用手指轻弹管壁，将管中胶液可能混有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入一层3～5mm蒸馏水，以防胶凝结时表面形成弯月面并隔绝空气。当见到水层与胶液交界处有一清晰界面时，表明胶已聚合。 2、预电泳 将乳胶管从凝胶聚合后的玻管中小心拔出，用滤纸吸去凝胶上层的水，把凝胶管插入到圆盘电泳槽的槽洞橡皮塞中。上下槽中加入稀释好的约250mL电极缓冲液，并使两管口都不存气泡。 为防止LDH及其同工酶受凝胶聚合后残留物(如 AP等)的影响，引起酶的钝化或其它人为效应，在加