毛蕊异黄酮对人乳腺癌细胞MCF―7增殖、迁移的体外研究.docVIP

毛蕊异黄酮对人乳腺癌细胞MCF―7增殖、迁移的体外研究 　　摘要：目的：探讨毛蕊异黄酮在体外对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和迁移的作用及其相关机制。方法：分别采用MTT法和Transwell小室测定毛蕊异黄酮对MCF-7细胞增殖和迁移能力的影响，对于细胞内VEGF蛋白水平的影响通过Western Blot进行检测。结果：毛蕊异黄酮呈剂量依赖性抑制了MCF-7细胞的增殖活性和迁移，与对照组相比，毛蕊异黄酮可明显降低MCF-7细胞中VEGF蛋白的表达。结论：毛蕊异黄酮对MCF-7细胞的增殖和迁移有抑制作用，其机制可能与下调细胞中VEGF表达有关。 　　关键词：植物雌激素；毛蕊异黄酮；乳腺癌；迁移 　　中图分类号：R737.9 文献标志码：A 文章编号：1008-240903-0022-04 　　乳腺癌是威胁全世界女性生命健康最严重的恶性肿瘤之一，每年有将近1200 000例新患者，然而临床上仍缺乏可有效治疗乳腺癌的药物，这就使得寻找乳腺癌治疗的有效作用靶点和新药物变得刻不容缓。植物雌激素因其分子结构与哺乳动物雌激素相似，能通过与雌激素受体相结合，发挥拟雌激素或抗雌激素生物活性，对激素相关疾病有一定作用，尤其对乳腺癌、卵巢癌和心血管病作用比较显著。植物雌激素主要有3类：异黄酮类、木酚素类和黄豆素类。其中毛蕊异黄酮属于异黄酮类，研究发现毛蕊异黄酮能抑制乳腺癌细胞和结直肠癌细胞的增殖，但毛蕊异黄酮对乳腺癌细胞迁移能力的影响却鲜有报道。本实验以雌激素受体阳性人乳腺癌细胞MCF-7为模型，观察毛蕊异黄酮对MCF-7细胞增殖、迁移的影响及其可能的作用机制。 　　1材料与方法 　　1.1细胞与培养 　　人乳腺癌细胞MCF-7从中科院上海细胞生物学研究所购得。细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基，放在37含5%CO2的培养箱中培养。 　　1.2 MTT法测定MCF-7细胞的增殖活性 　　取对数生长期细胞，用含10%FBS的DMEM培养基将细胞混悬成单个细胞悬液，以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔培养板，每孔体积为100μl，待细胞贴壁后更换含不同浓度毛蕊异黄酮的培养基，于48 h后加入MTT溶液10μl，37放置4 h，小心弃去孔内所有液体后每孔加入150μl二甲基亚砜，振荡10 min将细胞中的结晶充分溶解，用酶标仪在490 nm波长处检测吸光值。 　　1.3 Transwell小室迁移实验检测MCF-7细胞的迁移能力 　　取对数生长期细胞，以无血清DMEM培养24 h，调整细胞密度为5×105个/ml。将孔径为12.0 μm的Transwell小室放入24孔培养板中，上室加入含不同浓度毛蕊异黄酮的细胞悬液200μl，下室加入含10%FBS的DMEM 500μl，培养24 h。取出Transwell小室，棉签小心拭去小室滤膜上表面细胞，4%聚甲醛溶液室温固定细胞20 min，0.1%结晶紫染色，于荧光显微镜下计数滤膜下细胞数，随机选取10个高倍镜下视野进行计数。每组设3个复孔，实验重复3次。 　　1.4 Western Blot检测MCF-7细胞中VEGF蛋白表达的变化 　　分别用0，50，100和150 μM毛蕊异黄酮处理MCF-7细胞48 h后，弃去培养液，PBS洗涤3次，裂解液在冰上裂解细胞30 min，用细胞刮刀将细胞刮下使其悬浮，提取出来的蛋白4，12000rpm离心20 min。将提取出来的总蛋白电泳，使不同分子量的蛋白分离开来，再转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温孵育2 h，TBST洗涤3次，接着孵育snti-VEGF抗体和anti-GAPDH抗体，在4条件下过夜。二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，超敏发光液发光，用凝胶成像系统照相扫描对其灰度值进行分析，以VEGF灰度值与内参GAPDH灰度值的比值表示其蛋白水平。 　　1.5统计学分析 　　数据以均数±标准差表示，采用SPSS 18.0统计分析软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1毛蕊异黄酮对MCF-7细胞增殖的影响 　　采用不同浓度的毛蕊异黄酮处理MCF-7细胞48 h后，MTT检测细胞的增殖活性。结果显示与对照组相比较，毛蕊异黄酮对MCF-7细胞增殖表现出明显的抑制作用，并呈剂量依赖性，以150μM处理组抑制效果最为明显，见图1。 　　2.2毛蕊异黄酮对MCF-7细胞迁移的影响 　　Transwell实验可见经不同浓度毛蕊异黄酮处理24 h后，MCF-7细胞迁移能力显著下降，表现为穿过小室细胞数目的不断减少，见图2。其中以150μM效果最显著，穿过小室的细胞数最少。 　　2.3毛蕊异黄酮对MCF-7细胞VEGF蛋白表达的影响 　　不同浓度毛蕊异黄酮均能降低M