第九章 动物细胞融合PPT.ppt

第九章 动物细胞融合 第一节 动物细胞融合的概念 19世纪30年代，人们相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞，19世纪70年代，在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的现象，但由于受当时对生物学认识水平的限制，人们对这一现象并没有给予足够的重视。 1957年，日本科学家岗田善雄在培养动物细胞时加入失去活性的仙台病毒，发现了细胞融合、产生具有两个核的细胞。 后来人们用此方法又成功地诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活，动物细胞融合技术随之诞生。现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学科的研究工作中。 细胞A 细胞B 杂种细胞 灭活的病毒 物理法 化学法 仙台病毒 疱疹病毒 新城鸡瘟病毒 概念：通过诱导两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）。如果2个不同的细胞进行融合，则称为细胞杂交（cell hybridization） 融合细胞的类型： 同核体（homokaryon）：由同一生物个体的细胞（基因型相同）所融合形成的融合细胞。 异核体（heterokaryon）：来自不同基因型的细胞所融合形成的杂交细胞。 1.生物方法（病毒） 病毒是最早采用的融合剂。某些病毒被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。 常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等。用作融合剂的病毒必须事先灭活（紫外线或β-丙内酯），使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。 第二节 诱导细胞融合的方法 仙台病毒是最常用的病毒诱导融合剂。优点：融合率较高、应用广（对各种动物细胞都适宜）、容易培养（可在鸡胚中大量繁殖）。 病毒介导融合的缺点： 不稳定，在保存过程中融合活性会降低；制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。 2. 化学诱导融合 化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。 PEG可以促使细胞凝结、破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。 影响PEG诱导融合效果的因素： 分子量与浓度：分子大、浓度高的PEG，有利于融合，但毒性也随之增大。一般用分子量PEG 1000-4000 ，40%-60% PH:8.0-8.2 诱导时间：长，效率高，但毒性增大、容易形成多核细胞 温度：38-40度 ?3.物理方法(离心，震动，电融合) 最常用的是电融合法 细胞在电场中排列成串、聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，促使细胞在相互接触的细胞膜处产生穿孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。 细胞电融合技术有许多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。 两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，如：?????1) 亲本细胞? ?????2) 同核体：同源细胞的融合体 ?????3) 异核体：非同源的细胞的融合体 ?????4) 多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体 ????筛选的目的是为了获得优良的杂种细胞 第三节 杂种细胞的筛选 融合细胞的筛选方法 1. 利用细胞形态、大小、颜色差异筛选 2. 利用抗药性筛选????亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感 ????亲本B：对卡那霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 ????杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长  3. 利用营养互补筛选：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 ???? 亲本A：色氨酸缺陷型 ????亲本B：苏氨酸缺陷型 ??杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。 4. 利用基因缺陷互补筛选 最常用的是在亲本细胞的嘧啶和嘌呤代谢途径中引入缺陷突变来筛选杂交细胞，即HAT筛选系统。 细胞合成核苷酸有2条途径：从头合成途径和补救途径。 阻断从头合成核苷酸途径的物质：次黄嘌呤(hypoxantin，H)、氨基蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin，T)。 HAT培养基：含有H、A、T的培养基 在HAT培养基上，细胞从头合成核苷酸途径被阻断，只能利用补救合成途径。 在补救途径中，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（简称HGPRT）和胸苷酸激酶（TK）起重要作用。 H