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第五章;第一节;一、细菌染色标本镜检 （一）染色标本检查的基本程序 1、涂片 2、干燥 3、固定 4、染色 染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染 料，碱性染料最常用 ;（1）单染法 用一种染料进行染色，可观察细菌的大小、形态和排列，但不能用于鉴别细菌。如：亚甲蓝染色法 （2）复染法 用两种或两种以上的染料进行染色，不仅可以观察细菌的大小、形态和排列。还可用于鉴别细菌，又称为鉴别染色。 鉴别染色—革兰染色 抗酸染色; 复染法的一般步骤 初染－→媒染－→脱色－→复染;（二）革兰染色法 1、染液组成： 结晶紫染液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释复红 ;2、染色方法 标本涂片，固定 ?结晶紫初染 （1分钟）→ ?碘液媒染（1分钟） → ?95%乙醇脱色（30秒）→ ?复红复染（3-5分钟） → ; 3、染色结果 兰阳性菌（G+）——紫色； 革兰阴性菌 (G-) ——红色。 ;;4、染色原理 （1）渗透学说：与肽聚糖结构有关 G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，复红复染后呈红色。;; （2）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关 （3）等电点学说：与细菌所带电荷有关 ;5、临床意义 鉴别细菌 选择用药 理解细菌的致病作用 ;6、影响因素 （1）操作因素 ★涂片的厚薄 ★脱色时间的长短 （2）染液因素 ★卢戈碘液放置时间过长 ★ 95％乙醇挥发 ★结晶紫与草酸铵混合时间太长 （3）细菌因素： ★细菌种类、 ★细菌菌龄;（三）抗酸染色法 用于鉴别抗酸杆菌和非抗酸杆菌 步骤：1、苯酚复红加温染色 2、盐酸酒精脱色 3、亚甲蓝复染 结果：抗酸杆菌为红色 非抗酸杆菌为蓝色;（四）其他染色法 1、特殊结构染色法;2、负染色法;3、荧光染色;二、细菌不染色标本镜检 应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式 常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法 ;压滴法;悬滴法;3、暗视野聚光法 4、相差显微镜检查法;（二）影响因素 1、操作因素 2、玻片因素 3、光线强度 ;第二节 细菌接种与培养技术;一、基本条件 （一）接种环与接种针 用于取菌、接种及分离细菌的器具 1、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及斜面接种 2、接种环用于划线分离培养、纯种接种、挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。 3、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌;（二）红外接种环灭菌器 利用红外线产热进行灭菌;（三）培养皿 制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的分离培养。;附：微生物检验常用玻璃仪器的准备 1、玻璃器材的种类及用途 2、玻璃器皿灭菌前的准备 玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。 ; 3、玻璃器材的清洗 ★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清水清洗 ★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗 细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷 ★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出－→洗涤剂洗刷－→清水冲洗 ★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗 ★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗涤 ★含油脂的器皿：单独灭菌;（四）培养箱 1、电热恒温培养箱 2、二氧化碳培养箱 3、厌氧培养箱;（五）培养基 培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。 1、培养基的成分及作用 营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂 指示剂;2、培养基的种类 （1）按培养基的物理性状分类 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于细菌的分离培养。 ;（2）按培养基的用途分类 基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA） 选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如SS平板 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。 厌氧培养基：用于培养厌氧菌;3、培养基制备的一般程序;二、细菌接种与培养技术 （一）无菌技术 1、细菌检验