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奶牛乳房炎 溶葡萄球菌素 立项依据 项目实施方案 实施方法 可行性分析 创新之处 本项目的创新之处在于通过构建溶葡萄球菌素基因的原核表达载体，为后期进一步的研究转溶葡萄球菌素基因的克隆动物做初步的探索。通过抑菌谱实验了解溶葡萄球菌素对当前能够引起奶牛乳房炎的大多数致病微生物的抑菌及杀菌作用. 实施计划 小组成员 * 溶葡萄球菌素的原核表达纯化和抗菌谱研究 指导老师：郭泽坤 项目组长：林吉辉 答辩人：支高峰 奶牛乳房炎症状为乳房实质、间质的炎症。病因多由机械性刺激、病 原微生物浸入及化学物理性损伤所致。分为浆液性乳房炎、纤维素性卡他乳房炎、化脓性乳房炎、出血性乳房炎、坏疽性乳房炎和隐性乳房炎。 1.发病率高，产奶量下降.据国际乳业联盟的资料，奶牛患临床型乳房 炎约占成母牛的2％，患亚临床型乳房炎约占成母牛总数50％。据 1983—1984年在宁夏银川、吴忠、贺兰3市县重点 调查，临床型乳房炎发病率占成母牛的3．3％，而亚临床型乳房 炎头数发病率达73．2％，乳区发病率40．4％(冬季)。 2.牛奶理化性质发生变化，乳品质量下降奶牛患乳房炎时，牛奶中 的干物质降低5％一15％，乳糖、钾含量减少，乳脂率下降，体细 胞数增加。乳制品风味也下降。 3. 提高牛群淘汰率,奶牛患临床型乳房炎的牛奶不能食用，必须废弃, 同时又要增加治疗费用，严重的病牛可丧失泌乳机能而被淘汰， 个别病牛可因败血症造成死亡。 4 .危害人类健康病乳中的致病菌可能危害饮用者的健康。 例如结核型乳房炎可传播结核病，化脓性链球菌导致猩红热和咽 喉炎，金黄色葡萄球菌能使人发生食物中毒等。用抗生素治疗乳 房炎有使人发生过敏反应的潜在危险。 危害 发现及近年发展状况： 溶葡萄球菌素（lysostaphin）来源于葡萄球菌 分泌于胞外的蛋白质产物，最早是由Schindler等人于1964年从模仿葡萄球菌Staphylococus simulans NRRLB-2628株的培养物中发现并分离的一种含有Zn2+的金属蛋白酶，属肽酶家族M23，具有内切酶活性，能够特异性裂解金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖的“五肽甘酰键”而杀灭金黄色葡萄球菌且不易产生耐药性。到目前为止，国内外已经有很多采用溶葡萄球菌素治疗奶牛乳房炎成功的病例。 2006年，王敬华等研究发现溶葡萄球菌素对h-VRSA有一定的溶菌作用；2007年，沈建忠等研究发现溶葡萄球菌素对引起奶牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌有很好的抑菌作用；2008年，白宁等研究发现溶葡萄球菌素能够在体外清除金黄色葡萄球菌的生物被膜；2009年，张继恩等研究发现重组溶葡萄球菌素对奶牛子宫内膜炎的治疗有一定的治疗效果。 溶葡萄球菌素对引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌的抑制及除菌作用是很明显的，并且得到了有利的证明，但在畜牧临床中奶牛隐性及临床型乳房炎的致病菌的类型是很多的，包括无乳链球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、化脓性棒状杆菌、坏死杆菌等多种致病微生物。 由于天然的溶葡萄球菌素产量很少，难以纯化，极大的限制了溶葡萄球菌素在畜牧临床上的应用。本研究通过构建溶葡萄球菌素原核表达载体，诱导表达并纯化溶葡萄球菌素蛋白，并选取数种能够引起奶牛乳房炎的细菌做抑菌谱实验，以期更进一步的了解溶葡萄球菌素对奶牛乳房炎的致病菌的抑菌及杀菌效果与强度，为后期的转溶葡萄球菌素基因动物的研究做初步的研究。 通过PCR的方法扩增溶葡萄球菌素基因 2.以pET28-ａ为载体骨架构建溶葡萄球菌素基因的原核表达载体 3.用原核表达载体转染表达菌BL21（DE3） 4.诱导溶葡萄球菌素蛋白的表达 5.溶葡萄球菌素蛋白的纯化 6.溶葡萄球菌素蛋白的抑菌谱实验 ，观察溶葡萄球菌素对能引起奶牛乳腺炎 的致病菌的抑菌圈的大小，对溶葡萄球菌素的抑菌作用作出初步的判断。 1.查阅资料，确定方案 通过三大数据库检索相关抑菌谱、溶葡萄球菌素、奶牛乳房炎的致病菌的资料，加深对课题的了解，理清研究思路细化课题研究方案与实施步骤。 2.实验材料准备 大量已纯化的溶葡萄球菌素蛋白和经培养的奶牛乳腺炎的致病菌。 3.实验过程 利用农业部家畜生殖内分泌与胚胎工程国家重点开放实验室的实验条件，在导师的指导下按照实验方案完成实验。 4.总结研究结果 1.对资料进行的大量的查阅，对实验方法及实验技巧有 一定的掌握； 2.指导教师在本课题的方面有一定的研究，有着丰富的经验，对于本课题的研究有着极大的帮助，对于本课题的顺利完成