exosomes外泌体实验方案.docxVIP

外泌体分离提纯草案By 朱旭峰以超高速离心的方法来分离外泌体（细胞上清）细胞培养液(CM)是来自无菌的80%-90%的培植细胞，并用浓度比1:1.000的蛋白酶抑制剂混合。（sigma）快速地将CM用0.22μm 的过滤筛(Millipore)过滤，来分离完整地细胞和残渣。超速离心于120,000_g (Sorvall WXULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃ .2 小时用1mL 冷的 PBS 重悬和清洗小囊泡，再次超速离心120,000_g (Sorvall WXULTRA SERIES, rotor A-641) 4 ℃ .2 小时再用100μL 冷的 PBS 重悬后转移到低粘附的管中快速地使用或置于-80℃中待用为检测外泌体的蛋白浓度，取2μL的样品置于卡上，用Direct Detect?(Millipore)材料细胞培养液蛋白酶抑制（Sigma）过滤筛(Millipore)冷的 PBS低粘附的管Direct Detect?(Millipore)以超高速离心的方法来分离外泌体（人血浆）在提取外泌体之前应该向血浆里添加1;500浓度比的蛋白酶抑制剂(Sigma)将上清液移至一个新的管中离心200*g 20分钟 4℃小心地再将上清液移至新的管中离心 10000*g 30分钟于4℃来去除较大的囊泡、此阶段的样品可以将样品用0.22μm的注射器滤筛(Millipore)过滤并且离心110000g (Sorvall WX ULTRA SERIES, rotor F65L) 2小时 4℃用冷的PBS重悬后再次超速离心(110,000g, 1 h, 4 ℃).，将外泌体小心干燥并且用冷的PBS重悬外泌体应该立即使用或-80摄氏度冷藏材料蛋白酶抑制（Sigma）过滤筛(Millipore)冷的 PBS低粘附的管Direct Detect?(Millipore)ExoQuickTM化学沉淀法ExoQuickTM的使用要按照厂家提供的说明书来实行该试剂盒可以简单地提取CM,人血浆，和血清里的外泌体，只需用倒相管按照所指示的量来加入ExoQuickTM试剂盒里的溶液溶液孵化过夜，在4℃温和的摇晃在流式细胞仪缓冲液中洗涤试剂盒里的带荧光的免疫磁珠已经被绑定，用流式细胞仪鉴定即可(BD Biosciences)配合使用CellQuest的软件。材料ExoQuickTM试剂盒流式细胞仪用METM分离外泌体样品（CM或人血清）要按照商品说明书(New England Peptide – NEP)稀释样品要事先处理好，17,000g 7分钟来去除微粒物质然后用METM试剂来孵化样品(NEP peptide)并且用旋转震荡在室温混合15分钟孵化完的样品要室温离心10000g 7分钟所有的样品要用PBS洗三次最后小囊泡要用合适的KIT缓冲液重悬抗体以下的外泌体有关的一抗和二抗是用作：Westen Blot，ELISA和FACS（流式细胞术）mAbaCD9, mAb aCD63, mAb aCD81, mAb aCD63-FITC, aCD81-PE, 来自于Beckton Dickinson, mAb aCD63-biotin (BioLegend),mAbaAlix (Santa Cruz),mAb aTsg101 (Abcam),pAb aRab5 (SantaCruz),mrAb aRab5 (Epitomics), mAbaCalnexin (Abcam),二抗是 anti-Mouse和 anti-Rabbit HRP-conjugated (Dako).专门的肿瘤外泌体 (HBM1 and HBM2) 结合抗体由HansaBioMed RD team.提供用Westen Blot 探测外泌体的蛋白将样品用合适容积的蛋白loading Buffer（Lonza）重悬在合适的浓度下用SDS分离外泌体的蛋白质把蛋白转到硝酸纤维素膜上（GE Healthcare）一二抗体孵化信号要在暗室里用ECL附加外泌体免疫捕捉和蛋白定量 ELISA从已经加了不同抗体的96孔板(Nunc)里的细胞上清或者人血浆为免疫捕捉而筛选外泌体结合抗体（96孔板的抗体用碳酸氢盐缓冲液PH=9.6稀释，用0.5%BSA固定和1%的蔗糖稳定）PBS加入0.05% Tween-20（PBST）作为洗涤缓冲液，但如果有提示说明，应该用PBS稀释样品将外泌体样本，CM，人血浆样本加入96板孔内（最终容积为100μl），孵化4℃过夜或者室温2小时（可以使用商业化的exosomes捕捉平板(HansaBioMed)）传统上的protocol包含使用主要的抗体（aCD9或aCD63）在样品缓冲液（0.5%BSA PBS）中稀释2小时于4℃。在大量的冲洗后，用辣根过氧化物酶