原来科学如此简单.pptVIP

--- 赫贝科技 原来科学如此简单;内容概要;实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析; 扩增曲线 荧光阈值 Ct值;Cycle（循环数）;Cycle（循环数）;Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数;横轴：PCR反映循环数;理想的PCR反应;非理想的PCR反应;在扩增产物达到荧光阈值时;Cycle number;线性关系、扩增效率确认;内容概要;非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe ;;热 变 性;问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 ;将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT);融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光 定量准确; 使用方便，不必设计复杂 探针 具有价格优势;Taqman探针法——原理;;1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同; 高度特异性 重复性好 灵敏度高 可进行多重定量; 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成;;高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低; 几种方法的应用比较;;内容概要; 绝对定量解析方法;;一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。 ;质粒标准品的制备;; 方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203） 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。;Sample;扩增效率（E）计算 E = 10-1/斜率 －1 = 10-1/-3.29 －1 = 2.01－1 = 1.01 ;未知样品拷贝数的计算; 相对定量解析方法;;相对定量分析方法;一个参照样本 一个或一个以上的未知样本 一个目的基因 管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。 一组标准样本（有些分析方法不需要）;管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等; 双标准曲线法 2 -△△Ct法 ; 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量