发育生物学实验 目的基因的发育表达图式.ppt

实验六 海洋动物目的基因的发育表达图式 二、组织原位杂交技术原理 定义：是一种应用标记探针与胚胎或组织细胞中的待测 核酸杂交（碱基配对），再应用标记物相关的检测系 统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术 作 业 电子版上交vasa mRNA在实验动物发育过程中的表 达图式； 根据实验结果，提出实验动物生殖系的起源模式； 思考：影响原位杂交成败的关键因子及原因 * 一、目的要求 掌握RNA原位杂交的原理; 熟悉胚胎整体原位杂交操作技术； 加深对发育过程中基因表达时空特性的理解 整体原位杂交（Whole-mount in situ hybridization ）： 将目的基因的探针于胚胎整体进行杂交的方法 地高辛（DIG）标记的UTP ALP标记的Anti-DIG抗体 ALP 碱性磷酸酶显色 DIG Anti-DIG抗体 ALP ALP底物 RNA原位杂交原理：主要是利用碱基互补原理，将体外合成的带有标记的单链反义RNA与组织或细胞中待测的mRNA发生杂交，从而将探针定位在特定基因的表达区域内。显色观察，确认其表达部位。 标记物的种类分为2种，即非放射性的标记物（地高辛(DIG)和生物素(BIO)）或带有放射性的同位素(32P)。 vasa基因——生殖细胞的标记分子 栉孔扇贝胚胎和幼虫 单环刺螠胚胎和幼虫 三、实验材料 四、胚胎原位杂交的实验流程 RNA探针设计合成 思考：如何确保探针特异性？ 反义RNA探针 正义RNA探针 HindⅢ线性化质粒 1 μg EcoRⅠ线性化质粒 1 μg 10×转录缓冲液 2 μl 10×转录缓冲液 2 μl 10×NTP 2 μl 10×NTP 2 μl RNase抑制剂 1 μl RNase抑制剂 1 μl T7 RNA聚合酶 2 μl SP6 RNA聚合酶 2 μl DEPC处理水 至20 μl DEPC处理水 至20 μl 胚胎固定：4％多聚甲醛(PBS配制)， 保存于100%甲醇中（-20℃） 体外转录 带有T7/SP6噬菌体转录启动子的载体 杂交流程（第一天） (12-16 h) 以上过程，为防止RNA酶污染，操作时需戴手套和口罩。 试剂和容器处理：DEPC（焦碳酸二乙酯）或180 ℃ 复水、消化、后固定 杂交、预杂交 杂交流程（第二天） (显色：30 min – 2 h) ·胚胎预处理 ·预杂交和杂交 ·洗脱和抗体孵育 ·显色和观察 实验主要阶段 思考：各关键步骤的目的和原理， 如何确定最佳条件 * * *