[理学]基因工程工具酶.pptVIP

六 其它DNA修饰酶 碱性磷酸酶：切去5’磷酸 核酸外切酶： S1核酸酶：降解ssDNA、ssRNA，对ssDNA活 性高 ※作用：切ssDNA成平齐末端 DNase/RNase ：水解DNA、RNA，要用EDTA 去激活，防止目的基因被 水解 ※RNase分布广：操作时要带手套，防止引入 RNase水解了目的RNA △RNase分类：RNaseA、T1、H ▲DNase分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ T4多聚核苷酸激酶： 末端脱氧核苷酸转移酶： ※本章总结 * * 基因工程工具酶 Made by lionchp 一 概述 核酸酶 定义：水解磷酸二酯键，使核苷酸链断裂的 蛋白酶 分类： DNase：水解DNA的核酸酶 RNase：水解RNA的核酸酶 外切酶：从核酸分子末端一个接一个降解核苷酸 内切酶：从核酸分子内部切割，使核苷酸分子断成 小片段 细菌的R-M体系： 定义：限制-修饰体系，细菌可识别自身DNA 和外源DNA，降解外源DNA—对外源DNA 有抵抗力 原理：修饰酶从SAM（s-腺苷甲硫氨酸）上转 移甲基到特定识别位点的特定碱基上，使DNA 甲基化，保证内源DNA不被限制酶降解 生物意义：保证内源DNA不被限制酶降解，快速降解未被甲 基化的外源DNA ※DNA复制过程中的甲基化：模板链是甲基化的，使子代DNA （半甲基化）不被限制酶降解，甲基化酶再将新合成链甲基 化，使子代DNA完全甲基化，防止被内切酶降解 二 限制性内切酶（限制酶） 命名：酶来源的微生物 属名：第一个字母 种名：前两个字母 株名：abcd… 该株中该酶编号：某株微生物中可能编码了 多种内切酶 ※例：Haemophilus influenzae的d株中发 现的第Ⅲ种内切酶--HindⅢ 限制酶识别位点特征： 专一性 大多有4-8bp：主要是6bp的，富含CG 大多为回文序列：反向重复序列,易切割出粘 性末端片段 切割位点在识别序列内：识别位点甲基化不 利于切割 AT↓CG AT →→ TA GC↑TA ※限制酶识别序列出现几率及酶切片段估算 假设：四种碱基出现概率相同（实际上CG 出现概率比AT大，但无影响） 一般酶切识别序列6bp：每46=4096个核苷酸中酶切位点有一次出现机会→ 内切酶识别序列出现几率：1/4096（每4096个核酸酶中出现一次） 长49000bpDNA中有：12个内切酶识别位点 （49000/4096） 切割方式： 成黏性末端：切割位点在识别序列中心轴两 侧 3’黏性末端：3’末端比5’长 5’黏性末端：5’末端比3’长 成平齐末端：切割位点在识别序列中心轴处 ※切割位点的标记：↓、/ ※同位酶、同裂酶与同尾酶 同位酶： 同裂酶：来源不同，但有相同的识别序列， 切割DNA后产生相同末端的一组限制 酶 同尾酶：来源不同，识别序列也不同，但切 割DNA后产生相同末端的一组限制酶 酶活影响因素 DNA纯度：杂质会降低酶活 DNA甲基化：DNA甲基化后稳定，不易切割 DNA分子结构：线性DNA易切，超螺旋难切； CG多难切 星活性： 酶的特异性改变而呈现的活性 缓冲液： 时间与温度：t=1-1.5h;T=37OC 反应体积与甘油浓度：保存时50%甘油防冻 融，反应时50%；酶体积在总反应体积1/10 以内，防酶活被抑制；反应体积：20-100ul ※酶活单位定义： 示例：典型的切反应酶 ★ ※三种限制酶 Ⅰ型： 不适用于基因工程。只在肠道 菌中发现 Ⅱ型： 基因工程的工具酶 Ⅲ型： 切割位点不在识别位点，一般离识别位点25 bp～27 bp，对分子克隆操作亦无实用意义 三 DNA连接酶 作用机理：利用NAD+或ATP能量，催化多段 DNA3’-OH与5’-P成3’，5’-磷酸二 酯键 ※步骤：酶+AMP+ATP→酶-AMP+ADP→酶-AMP-P-DNA→酶+AMP+DNA-P-DNA 特点： 能量来源：所有真核生物的DNA连接酶都是利 用ATP提供能量。细菌的DNA连接酶都是依赖 NAD+的。只修复切口，不修复缺口 分类 T4DNA连接酶： 可连接