基因转染技术及其应用简介教材.pptVIP

动物乳腺反应器 是指利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并能从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。 特点： 1.对转基因动物的影响小 2.产量大，产品易提纯，质量高 3.表达产物生物活性稳定 4.易于扩群，进行规模化生产 5.缩短新药上市周期 6.可以获取巨额经济利润 （四）基因治疗 1.基因治疗(gene therapy) 是指将外源功能性目的基因导入病人体内，通过调控目的基囚表达，抑制、替代或补偿缺陷基囚，从而恢复细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法 2.治疗方式： （1）基因直接注射法(in vivo)： 即经静脉或肌肉直接将带存外源DNA的病毒、脂质体或裸露的DNA注入患者有关组织，使其进入相应的细胞并表达。 （2）体外基因转移再回输体内的方法(ex vivo)： 即将患者的体细胞(如T淋巴细胞)取出在体外培养并导入外源目的基因后重新输回患者体内。 3.基因治疗的策略 （1）基因置换 （2）基因补偿 （3）基因失活 （4）免疫基因治疗 （5）活化前体药物基因治疗 （6）耐药基因治疗 （五）RNAi技术 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 RNAi 一、RNAi早期研究和理论形成 二、参与RNAi的重要分子 三、 RNAi作用机制 一 、 RNAi早期研究和理论形成 (一)、RNAi早期研究 1、牵牛花实验 1990年，Arizona大学的Rich教授在转基因实验室将紫色素基因导入至矮牵牛花植物，目的是想通过增加紫色素基因拷贝获得具有更多的紫红色的矮牵牛。结果出乎意外，增加花瓣紫色的着色失败，一些转基因的花出现全白或部分白花，色素合成不是增加了，而是减少了，事实上，不仅导入的基因未被表达，反而植物本身的基因也失活或受到某种程度的限制。这种现象称为共抑制（cosuppression)现象。 基因转染技术及其应用简介 报告人: 陈 红 平 2006年11月 安德鲁·法尔和克雷格·梅洛 报告内容 一、基因转染简介 二、基因转染的基本方法 三、基因转染技术的应用 (1)目的基因 是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段 (2)目的基因常用的制备方法 1.目的基因的制备和获取 A.限制酶切除 a.从原核基因组DNA制备－视原核基因组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。 b. 从真核基因组DNA制备 c.从已克隆的DNA片段制备 B. PCR或RT/PCR方法制备目的基因 a. 获取已知基因 据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知） → 设计/合成一对引物 → PCR（基因组DNA为模板）/RT-PCR(mRNA为模板) → 从组织或细胞制备目的基因 b. 构建RT/PCR文库法获取未知基因 据mRNA末端如polyA尾设计共同引物 → 将所用mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体→ 构成PCR－cDNA文库筛选 C.计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因片段，这有赖于各种计算机软件的应用。 D.化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪，对目的基因分段合成，连接，可以得到所需的目的基因。 2.哺乳动物细胞表达载体的选择 哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体 （1）质粒型载体 哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。 A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件: a.启动子 b.增强子 c. 多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择标记基 e. 报告基因 f.表位标签 B.常用的哺乳动物表达质粒载体 a. pcDNA3.l b. pSI c. pCMV-HA d. pBudCE4.1 e. pTRE （2）病毒型载体 病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒和杆状病毒等。 A．逆转录病毒载体 逆转录病毒的优点是，