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免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)PPT
* 免疫共沉淀 (CO—immunoprecipitation) ? ? 用抗体将相应特定分子沉淀的同时,与该 分子特异性结合的其他分子也会被带着一 起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证 蛋白质之间相互特异性结合。 免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细 胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。 基本原理 ? 细胞裂解物中加入抗体,这样可与已知抗 原形成特异的免疫复合物,若存在与已知 抗原相互作用的蛋白质,则免疫复合物中 还应包含这种蛋白质;经过洗脱,收集免 疫复合物,然后分离该蛋白质,对该蛋白 质进行N端氨基酸序列分析,推断出相应的 核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细 胞构建成cDNA文库,以上述核苷酸序列为 探针从cDNA文库中分离出cDNA克隆 。 实验流程 ? ? ? ? ? ? (1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适 量细胞裂解缓冲液(含蛋白 免疫共沉淀酶 抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于 4°C, 最大转速离心30 min后取上清; (2)取少量裂解液以备Western blot分析, 剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解 液,4°C缓慢摇晃孵育过夜; (3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量 裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min; (4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖 珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连; (5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底; 将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液 洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲 液,沸水煮5分钟; (6)SDS, Western blotting或质谱 仪分析。 ? 一、 样品处理: 二、 抗体-agarose beads孵育 三、 抗体-agarose beads复合物洗涤: 四、 鉴定 免疫共沉淀技术的优点与局限性 ? 优点: 与蛋白质亲和层析一样,检测的产物 是蛋 白质的粗提物; 抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的 浓度存在,避免了过量表达所造成的人为效 应; 蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在; 复合物以天然状态存在,蛋白的相互作用 可以在天然状态下进行,可以避免人为影响, 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复 合体. *
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