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基本步骤 包被： 将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。 亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。 脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。 包被条件： 包被液：pH9.6碳酸盐缓冲液、pH7.2的磷酸盐缓冲液、 pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。 包被缓冲液的选择要依靠你所包被的物质而定，没有绝对的选择，但有一个原则就是要尽可能的保持包被物的活性不被损失。目前常用的包被缓冲液有PBS、CBS、tris盐缓冲液、咪脞缓冲液等，一般来说，缓冲液的pH要大于蛋白质的pI，以保持其活性。 碱性包被液如碳酸缓冲液用的较多，尤其是在小分子和载体蛋白的偶联物的包被，其主要的优势在于碱性环境可以使蛋白更容易与板子结合。也有用PBS和柠檬酸缓的，但是比较少见。 洗涤： ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。常用的洗涤液为含0.05% 吐温20的磷酸盐缓冲液，洗涤3次，5 min/次。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。 封闭： 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而避免ELISA后续步骤中抗原或抗体与固相载体的直接吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭。 孵育： 抗原抗体完成反应的保温过程称为孵育，通常37℃孵育0.5-1 h。 应注意孵育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 显色： 于各反应孔加入临时配制的TMB底物溶液0.1 ml，37℃反应10-30 min。 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。 结果测定： 于各反应孔加入2M硫酸0.05 ml，终止反应；拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。于450 nm处，以空白孔调零后测定各孔OD值。 结果判定： 目测定性法：加入底物经酶解和终止反应后，肉眼观察阳性孔颜色明显深于(竞争法则浅于)阴性对照；与阴性对照的颜色接近者，判定为阴性。 以P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；P/N值小于2.1，但大于1.5为可疑；P/N小于1.5为阴性。 对照设定 阳性对照和阴性对照是检验试验有效性的控制品，同时也是作为判断结果的对照。 阳性对照的基本组成应尽量与检测标本的组成一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。 参考标准品：定量测定应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度。 ELISA的应用 ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。 检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，其敏感性与RIA相当，在血液学方面可用于检查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等，在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）。 检查抗体方面：用ELISA间接法检查