免疫学诊断2011PPT.ppt

免疫学检测技术 的基本原理; 免疫学诊断; 目的要求;(一)抗原抗体反应的特点;;（二）抗原抗体反应的影响因素 电解质 抗原抗体（等电点pH3-5和pH5-6）在中性或弱碱性条件下带有负电荷，需适当浓度的电解质（如0.85%NaCl）才会结合； 温度 通常为37℃ 酸碱度 最适pH值在6-8之间。pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。;;⑴直接凝集反应的作法及应用;;;2.沉淀反应;★单向免疫扩散的应用;★对流免疫电泳可检测： 血液中的HBsAg和AFP ;3.免疫标记技术;★免疫印迹法;(1)酶免疫测定法（ELISA） ： 1971年瑞典学者Engvail和Perlman- nn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。 ; 抗原或抗体的检测;此法是测定抗体最常用的方法。 ; 抗原或抗体的检测; ;BAS-ELISA:可用来检测细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。 生物素与抗生物素有极高的亲和力，利用抗生物素为桥梁，联结生物素化的抗体及生物素化过氧化物酶，可获得极高的敏感性（多级放大系统）。 ; BAS-ELISA法：敏感性更高。用于抗原、抗体以及DNA、RNA的检测。; 抗原或抗体的检测;磁性微粒子固相：直径2.8微米，粒子小，悬 液类似液相；包被面积大；磁吸引分离方便。; 抗原或抗体的检测;免疫组化技术;(2)免疫荧光技术 是用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、藻红蛋白等.;直接荧光法：检测不同的抗原，需要不同的特异性荧光抗体 间接荧光法：用一抗与样本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。此方法既可检测抗原又可检测抗体。若查抗原，一抗为已知的；若查抗体，抗原是已知的。一种荧光抗体可用于多种不同抗原的检测 ;(3)放射免疫测定法(RIA）：是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点. 用于激素、药物等微量物质的检测，敏感性可达到pg/ml水平。常用的放射性核素有131I和125I等。;(3)化学发光免疫技术（CLIA）： 将化学发光（如鲁米诺）分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。 特点：灵敏度高、特异性强 分离简便、自动化分析。;（4）免疫胶体金技术（ICS）： 用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术。 ;（5）免疫印迹技术 又称Western blotting，是将十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离得到的蛋白转移到固相载体膜上，再用标记的特异性的抗血清或单克隆抗体对蛋白质进行定性及定量分析的技术。敏感性为1～5ng。;4、蛋白质芯片技术 常用于微生物感染的检测。其原理是将各种蛋白质固定于载体上制成芯片，再用荧光标记抗体与芯片作用，洗去未结合的抗体后，用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点荧光强度，以此检测荧光对应的抗体及其相互结合的程度。;三、免疫细胞的测定;常用的方法：葡萄糖-泛影葡胺密 度梯度离心法。;免疫吸附分离法： 将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，表达相应细胞表面标志的淋巴细胞可被吸附在培养板上，即可与其他细胞分开。 ;免疫吸附分离法 ;免疫磁珠法:应用较广泛 是一种特异性分离所需淋巴细胞的方法。首先将特异性抗体（如抗CD3、抗CD4或抗CD8等）吸附在磁性微珠上，与待测细胞悬液中的相应细胞特异性结合后,再将磁珠结合细胞与未结合磁珠细胞分开，即可获得纯度高的所需细胞。 ;磁珠分离法;荧光激活细胞分离仪分离法： （流式细胞术分离法） 是一种集光学、流体力学、电力学和计算机技术于一体，可对细胞进行多参数定量测定和综合分析方法. ⑴定量分析活细胞表面表达的特异分子 ⑵免疫细胞分析和细胞计数。 ⑶白血病和淋巴瘤的免疫学分型。 ⑷细胞周期和细胞凋亡检测。;流式细胞术 ;抗原肽-MHC分子四聚体技术 将特异性抗原肽段、可溶性MHC-Ⅰ类分子重链及β2微球蛋白在体外正确折叠，在亲和素存在下构建四聚体，并结合流式细胞仪定量检测外周血及组织中抗原特异性CTL的比率。 ;淋巴细胞及其亚群的分离;1.T淋巴细胞功能的测定 ⑴ 形态学方法：T淋巴母细胞转化试验. ⑵3H-TdR掺入法:灵敏性高,但有放射污染. ⑶MTT法：灵敏性不及3H-T