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实时荧光定量PCR技术 原理 应用及实践PPT
实时荧光定量PCR技术原理、应用及实践;*;*;*;*;*; 用我们的产品发表的部分SCI文章; 主要内容 ;PCR:伟大的天才发明;PCR:基本原理; PCR:基本原理;;Real-time qPCR; 扩增曲线(primary curve);; Ct 值(Cycle Threshold); Ct 值(Cycle Threshold);Ct值可以确定初始模板量?;;y = -ax+b 测定荧光定量PCR反应的有效性
-- 线性的标准曲线:相关系数R2
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扩增效率(E)=10-1/斜率-1; 荧光定量PCR检测方法;;; SYBR Green I;;融解曲线分析; Taqman 工作原理; Taqman 工作原理; SYBR Green I与Taqman 对比; 荧光定量PCR解析方法;;;相对定量;*;2-ΔΔ Ct法;;相对定量分析; 相对定量举例;; SYBR Green法实验流程 ; 样本处理与RNA提???; 逆转录; RT-PCR一步法还是两步法?;荧光定量PCR体系;总原则与普通PCR相同:
避免引物二聚体,避免二级结构
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推荐做跨intron设计;Master mix;Master mix的优化;Master Mix;
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使用Master mix
配置预混体系
设置生物学重复(不同个体)
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阳性和阴性对照
; 数据分析;操作注意事项;荧光定量PCR仪;荧光定量PCR仪;案例分析 总体原则;案例分析– 扩增曲线;扩增曲线
-- 低浓度样本没有稀释好
-- 重复性差,加样存在误差;;案例分析;案例分析– 扩增曲线;案例分析– 扩增曲线;案例分析– 熔解曲线;案例分析– 熔解曲线;各点之间线性关系
各孔的重复性; 案例分析– 标准曲线; 扩增效率低
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