实验四-酶联免疫吸附试验-ELISAPPT.ppt

实验四 阻断酶联免疫吸附试验（阻断ELISA) 免疫标记技术 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法：131I，32P 免疫荧光技术：FITC，PE 免疫酶测定法：HRP，AP 免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) 特点： 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 分类： 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 1.定义 2.原理 （1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。 （2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。 3.常用种类 直接法（direct ELISA）： 将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体 检测抗体 间接法（Indirect ELISA）： 将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗 检测液相中未知抗体 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体 阻断法（Block ELISA) ： 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体 检测液相中的可溶性抗体 （1）? 直接法测定抗原 A.????? 将抗原吸附在载体表面； B.????? 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 （3）双抗体夹心法测定抗原 A.????? 将抗体吸附于固相表面; B.????? 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C.???? 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 （4）竞争法测定抗原 A.???? 将抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 （5）阻断法测定抗体 本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。 A.?将抗原吸附在固相载体表面; B.先加待检血清（抗体）, 形成抗原-抗体复合物; C.??再加酶标单抗； D. 加底物。 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 4. 原理（以ELISA为例）： 显色 酶标单抗 酶标单抗 实验材料 猪伪狂犬病毒（PRV） —— 抗原 阴性对照 阳性对照 样品 —— 待测猪血清 HRP标记猪PRV单抗—— 酶标单抗 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB（四甲基联苯胺） ，底物缓冲液，30% H2O2，新鲜配制 酶标板，酶标仪 阻断法测定猪伪狂犬病病毒ELISA抗体 ——定性检测 实验方法 1.抗原的处理： 2.包被抗原： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液 4℃，湿盒内，18h 取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 3.加待测血清 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 1 2 3 4 阴性 空白 阳性 待测 4.加单抗： 37℃，湿盒内，30min 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 各孔加入酶标单抗100μL/孔 37℃，湿盒内，30min 5.显色： 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 加入底物溶液100μL/孔 避光显色，10min 6.观察结果 实验方法 1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检血清1∶1稀释后加入板孔中，每孔加100μl。同样1∶1稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔100μl。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30分钟。 2、洗板：甩掉板孔中的溶液