细胞冷冻保存技术　.pptVIP

第一章 动物细胞培养的方法; 细胞冷冻保存技; 细胞的低温保存; 一般在原代或传代2－10次内即大量冻存，作为原种（stock cells），取一支细胞进行传代繁殖，用毕再冻存，这样可保证长期使用和延缓衰老 。;;非玻璃化冷冻; 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶，从而减少细胞内冰晶对细胞的损伤；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。;在细胞冻存时加入冷冻保护剂，可以保护细胞免受冷冻损伤。 原理：1.常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点 2.提高胞膜对水的通透性，促进细胞内水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的损伤；解冻时，促进细胞外水进入细胞内，缓解渗透性肿胀。 3.稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。;在培养液中添加的保护剂：;冻存和复苏的原则：慢冻快融;冻存培养细胞; ;(4)冻结好的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。温度达-150~-190 ℃ ，细胞几乎处在停止状态。 冷冻时带手套操作，以免冻伤。 ;慢冻程序;缓慢冷冻的简化程序;;-196℃液氮罐;解冻程序;玻璃化冷冻;解决办法：通过添加高浓度的冷冻保护剂，可以显著降低形成玻璃化所要求的降温速度。一般冷冻保护剂的浓度为40%-60%。 冷冻保护剂：DMSO、乙酰胺、丙二醇、聚乙二醇等。;玻璃化冷冻的程序;;-196℃液氮罐;解冻程序;;;悬浮细胞复苏方法;　贴壁细胞的复　　;步骤　　　;细胞培养(cell culture）：即细胞（包括单个细胞）在体外条件下的生长。在细胞培养中，细胞不再形成组织。 细胞杂交（cell hybridization）：两个或多个不同的细胞融合。导致一个含核体(aynkaryo）的形成。; 体外培养转化（in vitro transformation）：细胞在体外培养中发生与原细胞遗传性状不同的变化，但不一定具有致癌性。 单倍体（haploid）：正常细胞染色体基本数（每一染色体只有一种）。 整倍体（euploid）：具有两个以上单倍体数目的细胞。;非整倍体（aneuploid）：细胞核内染色体数为单倍染色体数的非整倍数时称非整倍体。 二倍体（diploid）：具有两套染色单体数目的细胞（2n）. *原代培养（primary culture）：从体内取出细胞或组织的第一次培养。 *传代培养（subculture）：也称再培养无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。 ;单层培养（monolayer culture）：培养细胞在底物上长成单层。 悬浮培养（suspension culture）：细胞在培养液中是悬浮状态生长。 *贴壁依赖性（anchorage-dependent）：为细胞需贴附于底物或支持物上才能生长的性质。 ;贴壁依赖性细胞(anchorage- dependent cell)：由它们繁衍出来的细胞（或培养物）只有贴附于不起化学作用的物体（如玻璃或塑料等无活物体）的表面时，才能生长，生存或维持其功能。 无贴壁依赖性（anchorage－independent）：不依赖于贴附底物或支持物上生长的性质。 ; 汇合（confluent）：细胞相互连接成片占据所有底物面积。 近汇合（sub-confluent）：细胞在底物上生长接近，但尚未完全汇合。 超汇合（super confluent）：单层培养细胞附在底物上生长，汇合后发展成多层状态。 接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象。;密度抑制（density inhibition）：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象。 群体密度（population density）：培养底物单位面积上单层细胞数目。 饱和密度（saturation density）：在特殊培养条件下，每平方厘米（单层培养）或每毫升细胞悬液内可达到的最大细胞数。 ;*细胞系（cell line）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。 亚系（sub－line）：由原细胞系分离出的具有与原细胞系不同性状的细胞系。 *细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。 亚株（sub－strain）：由原细胞株分离出的具有原株性状不同的细胞株。; *细胞一代时间（cell generation time）：单个细胞两次连续分裂的时间间隔。 代或世代（generation）：细胞经过一次分裂完成的过程；实际应用往往指再培养（Subculture）。 *群体倍增时间（population doubling t