2012IGEM国际生物合成竞赛试验手册.PDF

2012 IGEM國際生物合成競賽實驗手冊 NCTU －FORMOSA N C T U _ F O R M O S A 2 0 1 2 i G E M 國際生物合成競賽實驗手冊 i 微生技術 I. LB 液態培養基的配製 1.以25g LB/1L 二次水的比例調配所需的量。先拿適當的血清瓶或燒瓶，取二次水。 2.放入適當大小的磁石，加入稱重好的LB powder ，放在加熱器上以適當轉速攪拌。 3. 等到LB powder 完全溶解後，在以5mL的 pipetman吸取 3mL或 5mL 至事先準備好的試 管中。 4.填裝完畢後，以鋁箔紙覆蓋在整個試管架上，並貼上滅菌帶，以121℃、30 分濕熱滅菌即 可。 5.依照實驗條件，LB試管使用前加入一定量的抗生素（抗生素 stock濃度 50mg/ml ，最終濃 度 25μg/ml ）。 II. LB agar plate培養基配製 1.以25g LB+15g agar/1L 二次水的比例調配所需的量。先拿適當的血清瓶或燒瓶，取二次 水。 2.放入適當大小的磁石，加入稱重好的powder ，放在加熱器上以適當轉速攪拌。 3. 等到powder 完全溶解後，以鋁箔紙覆蓋在燒瓶瓶口並貼上滅菌帶，以121℃、30 分濕熱 滅菌即可。 4.滅菌完畢後，在室溫下靜置（需注意底部是否凝結），直到其溫度約在65度左右(手掌可 忍受卻不燙傷) ，即可進行倒盤。 5.倒盤前，依照需求加入定量的抗生素（抗生素 stock濃度 50mg/ml ，最終濃度25μg/ml ）。 每個9 cm 無菌培養皿約緩緩倒入10 ml LB- agar目測( ) ，輕輕搖晃培養皿使其分佈均勻。 6.確定無氣泡殘留後於室溫中放置 30 min ，待凝固後倒放避免水氣凝集於培養基上造成污染。 7.取一培養基放置於 37℃培養箱培養 overnight觀察有無長菌。 8.其餘培養基保存於冰箱中留待使用，盤子側邊需註明所使用之抗生素，ampicillin畫一線， chloramphenicol畫二線， kanamycin畫三線， tetracycline畫四線，同時外包裝之塑膠袋也 須寫上日期、抗生素、配製人。 III. 畫線法 1.於LB-agar培養盤背面標記宿主名稱、抗生素抗性與自己姓名及日期。 N C T U _ F O R M O S A 2 0 1 2 i G E M 國際生物合成競賽實驗手冊 1 2.將接菌環燒紅，待冷卻後沾取菌液。 3.選擇 plate 一角畫3~4條線為第Ｉ區，再將接菌環燒紅，待冷卻。 4.旋轉培養基，自I區塗佈的邊緣再橫劃數條線到未接種的區域（ II 區）。 5.重複步驟 3動作，完成 III 區與 IV 區。 6.灼燒接種環，將接種環歸位。 7.37℃恆溫培養箱中放置 12~16 hr(overnight) 。 8.若得單一菌落，將此培養盤以 parafilm 封住，並置於4℃冰箱中保存。 ※用途：短時間菌種保存、colony單離 …等。 標記 IV. 塗佈 法 1. 將玻璃塗抹棒以酒精灼燒並冷卻。 2.由轉型步驟完成之 ependorf中，取適當菌液加入 LB agar plate中，使用冷卻之玻璃棒均 勻塗開，塗至plate在輕晃下無明顯的菌( )液體流動即可 。 3.在 37℃恆溫培養箱中放置 12~16 hr後，挑取所需之單一菌落培養後，以 parafilm 封盤冷藏 至4℃冰箱 。 ※用途： transformation的最後一步。 V.單一菌落培養 將接種環燒紅後，放置一旁冷卻，此時於玻璃試管內加入3 ml LB broth ＋3 μl 25 mg／ ml (1000:1)的抗生素（ Final concentration: 25 μg/ ml ）混合均勻，待接種環冷卻後，即可在培 養基上挑