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中国试剂网 3.16.2.6 丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持 介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点： ①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和 N ，N 甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝 胶有 格子是带有酰胺侧链的碳碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电 渗作用比较小，不易和样品相互作用。 ②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比， 形成 不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分 离物质分子 的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较 好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺 77.5%的凝胶，机械性能适用于分离分 子量范围不 1 万至 100 万物 质，1 万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺 1530%的 凝胶，而分子量特别大的可采用含 丙烯酰胺 4% 的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则 难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增 加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进 凝胶的机械性能。 ③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直 接测定。 ④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原 料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双 丙烯酰胺称交联剂， 在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝 胶。 在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发 剂和 另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递， 使丙烯酰胺 成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速 度。常用的引发剂 和加速剂的配伍如下表： 聚合反应催化剂配伍 引 发 剂 加 速 剂 （NH4)2S2O8 TEMED 中国试剂网 3.16.2.6 (NH4)2S2O8 DMAPN 核 黄 素 TEMED 注：(NH4)2S2O8，过硫酸胺 TEMED ：N ，N ，N ，N; 四甲基乙二胺 DMAPN ： β －二甲基胺基丙晴 用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引 发，需要强光照射反应液， 称光聚合反应。 聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素 影响： 1 、大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反 应液与空气 隔绝。 2 、某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。 3 、某些化学 药物可以减慢反应速度，如赤血盐。 4 、温度高聚合快，温度低聚合慢。 以上 几点在制备凝胶时必须加以注意。 凝胶的筛孔，机械强度及透明度等很大程度 上由凝胶的浓度和交联决定。每 100 亳升 凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克 数称凝胶浓度，常用 T%表达；凝胶溶液中交联剂 占单体和交联体总量的百分 数称为交联度，常用 C%表示，可用下式计算： 公 式 a ：丙烯酰胺克数； b ：甲撑双丙烯酰胺克数； ：缓冲液体积 （毫升） 凝胶浓 度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。 交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。 聚丙烯酰 胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三 度 空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的 大 小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不 仅是单纯 的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必 须注意与凝胶本 身有关的各种性质 （网孔的大小和形状等）。可通过下式计算来 选择适当的凝胶网 孔。 公 式 式中：P 为网孔平均直径，C 为多聚体浓度，d 为该多聚体分子直径 （若不 是卷曲的分 子应为 5A ），K 为常数，K 值取决于涨胶的几何构型，假如多聚体 的链是以近似于直角 交联的，则约为 1