叶绿体类囊体的Hill反应活力测定.PDF

一、叶绿体(类囊体)的Hill反应活力测定 一、叶绿体(类囊体)的Hill反应活力测定 叶绿体是植物进行光合作 用的细胞器，依据分离所 得叶绿体的结构完整程 度，大致将它分成两类： 被膜破碎的叶绿体（类囊 体）具有光合电子传递、 光合放氧和光合磷酸化的 功能 被膜完整的叶绿体 具有 同化二氧化碳的完全的光 合作用功能。 下面介绍类囊体的制备及 其Hill反应活力测定。 • （一）实验原理 • 用STN （Sucrose, Tricine或Tris, NaCI ） 提取并经分级离心的叶绿体碎片，具有 完整的类囊体，把其放入一定的反应介 质中给予照光，能通过反应中心的电子 传递进行希尔反应、放氧和光合磷酸化。 当用Fecy(Fe3+)作为电子受体时，它接受 电子还原为Fe2+ ，而Fe2+ 可与邻菲啰啉 （OP ）反应生成红色的络合物，510nm 下的OD与Fe2+ 的浓度成正比，由此可测 定希尔反应活力。 Fe3+ + ADP+32Pi Fe2+ + AT32P+H O 2 Fecy • （四）实验步骤 • 1. 配制STN研磨液 • 取Tricine （或Tris,0.2mol/L, pH值7.4 ）10ml、 Sucrose （1 mol/L）40ml 、NaCl （0.1 mol/L ） 10ml，定容到100ml。 • 2. 希尔反应活动测定 • （1）将STN、研具、烧杯、离心管、纱布 放入冰箱冰冻(约15分钟) 。 • （2 ）样品洗净后放入冰箱(4℃~8 ℃) 15- 20min 。 • （3 ）配制反应液。使其最终浓度为： Tricine （或Tris,pH值8.0 ）50mmol/L、 MgCl2 2mmol/L 、Fecy 1mmol/L 、 Na2HPO4 2mmol/L 、ADP 1mmol/L 。配好 反应液后分装入指管，每只2ml 。 • （4 ）水浴调温。把玻璃缸的水温调至合 适范围（菠菜、小麦、蚕豆20 ℃，水稻 25 ℃），其内放入指管。 • （5 ）叶绿体（类囊体）的提取。 • 叶片去中脉剪碎 • 加STN （约5-10ml/g ） • 迅速研磨成颗粒状 • 四层纱布过滤， • 离心 • 4000r/min离心1 min~2 min， • 沉淀悬浮（1~2mlSTN） • 离心1000r/min1 min, • 上层液于另一只试管，用STN稀释到 约含叶绿素200µg/ml ，放入冰浴用于测定Hill 反应活力和叶绿素含量。 • （6 ）照光反应。 • 调准缸内水温，每管加叶绿体提取物 0.2ml，开灯照光1min，闭灯后立即加 20%TCA 0.2ml 以中止反应。以照光前加 0.2ml 20%TCA 的对应试管作对照。 • （7 ）Fe2+ 的测定。 • 将上述试管以4000r/min离心2min ， 取二支试管，放入试管（用遮光试管架） 中，分别取离心后的上清液0.7ml，加 Na C H O 溶液（0.2mol/L ）2ml 、水1ml、 3 6 5 7 FeCl （0.01mol/L ）0.1ml、OP