引物设计和Primer-BLAST的应用-abc.PDF

引物设计和Primer-BLAST的应用 Lv Peng 2015.11.18 CONTENT 1.PCR- 引物设计目的 2.引物设计原则 3.设计引物软件 4.在线设计工具 5.probeBase 简介 1.1PCR （Polymerase Chain Reaction） 聚合酶链式反应 1971 1985 1986年5月 Khorana Kary Mullis Mullis在冷 泉港实验室 提出设想 发明了PCR 做专题报告 冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory ，缩写 CSHL ），又译为科尔德斯普林实验室。 几不同的PCR技术 1.扩增已知序列两侧DNA的PCR：反向PCR （Inverse PCR， IPCR）、锚定PCR （anchored PCR ）、RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends ）、连接介导的PCR （ligation- mediated PCR，LM-PCR）； 2.检测有限量稀有靶序列，即一对引物扩增产物不足以以通 过凝胶电泳观察到的时：巢式PCR （nested PCR）； 3.快速、灵敏、特异而准确定量的PCR：实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR ，RQ-PCR）。 1.2引物设计原则 引物特性及优化设计 特性 优化 碱基组成 （G+C ）含量应在40%-60%，4种碱基要分布均匀； 长度 一般为18-27个核苷酸长度。上下游引物长度差别不能大于3bp； 重复和自身互补序列 不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在； 上下游引物互补性 一个引物的3’末端序列不能结合到另一个引物的任何位点上； 解链温度（Tm ） 两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物与引物的Tm值相差不能大于 10℃ 3’末端 引物3’末端碱基尽量为G或C，不能使3’末端有NNGC或NNCG序列 引物序列 不要有局部的GC rich或AT rich （特别是3’端），避开T/C或A/G 的连续结构 1.3常用引物设计软件 Primer Premier 6 （P6）、Beacon Designer 8 （DB） （自动搜索） Oligo 6 （引物评价） Vector NTI Suit （综合分析） Primer Express （实时定量PCR引物和探针设计） *Omiga *Dnastar 1.3.1 Primer 6和BD 8设计引物参数 • 斑