聚合酶链式反应PCR扩增和扩增产物克隆.PDFVIP

  聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第一节 概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA  的方 法.它包括三个基本步骤:  (1) 变性(Denature): 目的双链 DNA  片段在 94 ℃下解链;  (2) 退火 (Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)  延伸(Extension):在TaqDNA  聚合酶合成DNA  的最适温度下, 以目的DNA 为模板进行合成. 由 这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4 ）,这些经合 成产生的 DNA  又可作为下一轮循环的模板,所以经 25‐35 轮循环就可使 DNA 扩增达 106  倍。  一、  PCR 反应中的主要成份  1.  引物：PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR 成败的 关键。引物设计和选择目的DNA 序列区域时可遵循下列原则：  (1)  引物长度约为16‐30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增 高。太长则比较浪费,且难以合成。  (2)  引物中 G+C