[医学]C9酶免疫技术.ppt

第九章 酶免疫技术 Enzyme Immunoassay 主要内容： Ab-E(Ag-E ) + Ag (Ab) （二）酶免疫技术的特点 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。  Section 2　酶标记物的制备 一、基本原理 ELISA结果：  Section 4　酶免疫印迹试验 斑点酶免疫试验  Section 5 与生物素-亲和素系统相关的酶免疫技术 1.高灵敏性 2.高特异性 3.应用广泛 4.简易、快速、稳定 二、与生物素-亲和素系统 相关的酶免疫技术  Section 6 均相酶免疫测定 均相酶免疫测定 一、HEI基本原理： 二、常用模式——（一）EMIT EMIT原理示意图： EMIT基本原理: （二）、CEDIA： CEDIA原理示意图： CEDIA基本原理： 相关性： 评价 HRP的底物 DH2+H2O2→ → → D+2H2O HRP 供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种 H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高 常用底物 酶和酶作用底物 HRP的常见底物 邻苯二胺 OPD 四甲基联苯胺 TMB 5-氨基水杨酸5-ASA 二氨基联苯胺 DBA 常用底物 酶和酶作用底物 OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。 TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。 　HRP的常见底物 酶和酶作用底物 AP的 底物 β-Gal 的底物 对-硝基苯磷酸酯（ PNP ） 4-甲基伞酮基β-D半-乳糖苷（ 4MUG ） 经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。 酶作用后，生成高强度荧光物 ，用荧光计 测量。 常用底物 酶和酶作用底物 四聚体、多价性； 亲和力高（亲和常数相同）； 活性基团：色氨酸（与生物素结合）； 非特异性吸附：AVSV。 ∵SV含酸性基团较多，偏酸性（PI＝6.0），不带任何糖基，而AV(PI=10.5),碱性环境中前者带正电荷少而此时Ag、Ab带负电荷，∴SV非特异性吸附远低于AV) 生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性，使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献。 要求 结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济 种类 塑料制品 微颗粒 膜载体 固相载体 将抗原或抗体结合于固相载体 用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附 包被coating 封闭blocking 包被与封闭 斑点 酶免疫试验 （经典方法） 技术方法 免疫印迹试验 （Western blotting） 酶免疫印迹试验 1.点样 2.加特异抗体 3.加酶标抗体 4.加底物显色 原理示意图 SDS聚苯烯 酰胺凝胶 加样 电泳 电转移 NC 方法学评价： 高分辨力、高特异性 高敏感性 用途： 抗原组分及其免疫活性的测定 疾病的诊断 免疫印迹试验 一、生物素-亲和素系统 （一）生物素 O C 生物素结构示意图 HN NH CH4 3CH 2CH H2C5 1 S (CH2)4COOH Ⅰ Ⅱ Ⅰ：咪唑酮环；Ⅱ：噻吩环 生物素化标记物 （Ag、Ab、酶等） 经化学修饰 带不同化学活性基团 活化生物素 标记蛋白质 结构 四亚基糖蛋白 四肽链蛋白 无糖基 PI 10.5 6 结合位 色氨酸 色氨酸 可结合B 4个 4个 Ka 1015 1015 活性 13～15 15～18 亲合素（A） 链霉亲合素(SA) （二）亲和素和链霉亲和素 （三）生物素-亲和素 系统的特点 技术类型 桥联亲和素-生物素法 （BAB or BRAB） 亲和素-生物素化酶复合物法 （ABC） 标记亲和素-生物素法 （LAB or BA） 固相－Ab ＋Ag+AbB+A+BE 固相-Ab –Ag-AbB-A-BE BE BE 显色，测OD值 S （一）BAB法 固相－Ab ＋Ag+AbB+AE 显色，测OD值