NDV抗血清的制备及抗体效价测定.pdf

NDV 抗血清制备及抗体效价测定 【实验目的】 1. 学习抗血清制备的基本原理，掌握兔和小鼠免疫注射方法、兔颈动脉放血、小鼠眼球采 血技术。 2. 学习双向琼脂扩散实验的基本原理，掌握的基本程序和结果判读方法。 3. 学习酶联免疫吸附实验 （ELISA ）的基本原理，掌握间接ELISA 的基本程序和结果判读 方法。 4. 学习免疫印迹实验的基本原理，掌握免疫印迹记实验的的基本程序和结果判读方法。 Part Ⅰ. NDV 抗血清制备 一、实验原理 将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应 B 细胞增殖、分化 形成浆细胞并分泌特异性抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血 清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇， 可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中 实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体 （Polyclonal antibody，PcAb ）。多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强， 效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、 次数、间隔时间及注射途径等。对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐 剂，以增强免疫性。 本实验介绍新城疫病毒（Newcastle disease virus ，NDV ）抗血清的制备过程。新城疫病 毒（Newcastle disease virus ，NDV ）又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病 毒分类学中的位置属于副黏病毒科（Paramyxoviridae ）、副黏病毒属（Paramyxovirus ）中的 一个种。该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全 群毁灭。以新城疫病毒灭活疫苗（Ulster 2C 株）灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠，制 备新城疫病毒抗血清。 二、实验仪器、材料和试剂 1. 仪器 1 5mL 无菌冻存管，2.5mL 和1mL 注射器，塑料静脉插管，碘酒，75 ％酒精棉球，剪刀， 止血钳，250mL 无菌三角瓶，50mL 无菌尖底离心管，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，5mL 吸头和移液器，温箱，离心机。 2. 材料 家兔：1-2kg 清洁级雄性或未孕雌免；小鼠：SPF 级6-8 周龄昆明鼠。 3. 试剂 鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗（南京梅里亚动物保健公司），0.01M PBS （pH7.2 ） （8 g NaCl，0.2 g KCl，2.9 g Na HPO .12H O，0.2 g KH PO ，以NaOH 调节pH 至7.2，加 2 4 2 2 4 双蒸水至1000 mL），麻醉剂：普鲁卡因溶液，硫柳汞。 三、方法和步骤 （一）NDV 兔抗血清制备 1. 家兔捉拿方法 动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一，正确的抓取固定动物是为了不损害 动物健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，保证实验顺利进行。家兔习性温顺，除脚 爪锐利应避免被其抓伤外，较易捕捉。拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。正 确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛，轻提动物，再以左手托住其臀部，使兔的体重主要落 在左手掌心（如图1）。 图1. 家兔的捉拿方法 2. 家兔固定方法 家兔的固定，依不同的实验需要，常用兔固定箱或兔手术台固定。 兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成，便于拆卸清洗消毒，一般用于固定兔子 狐狸貉子等。使用时时可将家兔置于兔固定箱内，在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等 小动物打耳号，灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等，常用于生理、药理 和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。 2 图2. 家兔固定箱固定方法 在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时，应将家兔以仰卧位固定于兔手术台 上。固定方法是：先以四条 1cm 宽的布带