[医学]105第五章 基因工程载体.pptVIP

第五章. 基因工程载体 载体类型基因工程所用的载体都经过人工重新构建 细菌质粒载体 ?噬菌体衍生载体 Cosmid载体（粘粒） 噬菌体M13衍生载体 Phagemid载体 酵母质粒载体 真核病毒载体 第一 节. 质粒 Plasmid 质粒是存在于细菌细胞染色体外、 能自主复制的小分子环状双链DNA分子。 又称为cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。 野生型质粒的大小一般在2-200Kb 基因工程常用者在2-4Kb之间 质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。 野生型质粒的特性 1. 自主复制性 质粒具有独立的复制子结构。 不受宿主细胞复制调控系统的控制。 2. 可扩增性 一个细胞内可有几个至几十个拷贝。 3. 可转移性 在天然条件下，质粒可从一个宿主细胞转移到另一个宿主细胞，甚至另一种亲缘关系较近的细菌中。 不相容性（不亲和性） 具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒，不能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象称作质粒的不相容性。 具有不同复制子结构的相容性质粒，尽管在细胞中的拷贝数可能不同，但在细胞分裂时，每种质粒在两个子细胞中可保持等同的拷贝数。 1 .质粒类型: 严紧型质粒(stringent plasmid) 1-5个拷贝/细胞 2. 质粒载体必须具备的条件 具有复制起始位点（ori） 具有抗菌素抗性基因以便于检测含有重组质粒的受体细胞 具有若干限制酶单一识别位点，即多克隆接头（MCS） 具有较小的分子量（一般小于5Kb)和较高的拷贝数 3. 质粒载体的选择性标记 抗菌素抗性 新陈代谢特性 常用的质粒载体 1.pBR322 2.pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。 3.融合表达载体：如GST融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱苷肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。当基因表达时，表达产物为GST与目的蛋白的融合体。 融合表达载体的优点 表达效率高 融合蛋白易纯化： 抗GST的蛋白质作为特异性抗体， 用亲和层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白； 可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点，可用适当的酶切割。 　 例如加装一段编码　Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子Ⅹa切割，从Arg后切开。目的蛋白中出现此种序列的可能性极小，因此该方法用途广泛。　 QIAexpress 6?His表达系统 重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。 6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的结构和功能，无需切除。 6个组氨酸残基免疫原性差，重组蛋白可以直接用做抗原。 噬菌体（bacteriophage, phage） 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 病毒的特性： 个体微小，可以通过细菌滤器 没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成 专性细胞内寄生的微生物 分布极广 噬菌体的生物学性状 噬菌体的生物学性状 形态 个体小，需用电子显微镜观察 蝌蚪形、微球形和丝形 M13噬菌体 单链DNA,基因组含6407个碱基.经过基因改造后，形成M13mp系列。 可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7倍). M13噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但妨碍宿主细胞的生长,因此可见培养平板上的混浊噬菌斑. 噬斑 单链的M13噬菌体（＋）进入受体菌后，以自身为模板，复制出互补链（－），成为双链的结构，称为复制型DNA。复制型DNA在细胞内可达200个拷贝。此时， （＋）链被特异的蛋白质阻断，不再生成新的（－）链。只能生成新的（＋）链。 （＋）链DNA被壳蛋白包装组成病毒颗粒，挤出宿主细胞， 科斯质粒载体 （cosmid） 又称粘粒载体，简称粘粒。 环形双链DNA分子，一般为4～6Kb。 人工构建的含有λDNA的cos序列和pBR322质粒序列的载体。该载体转化效率高。可容纳高达45kb的外源DNA。以感染方式进入宿主细胞,在宿主体内象质粒那样复制. 粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。又能像λDNA一样体外包装，并高效导入受体细胞。 属松弛型质粒，拷贝数较多。 农杆菌Ti质粒 根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌与植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤，故名Ti质粒（tumor inducing plasmid）。 Ti