[自然科学]树莓中覆盆子酮与苯亚甲基丙酮合酶基因克隆.ppt

树莓中覆盆子酮与苯亚甲基丙酮合酶基因克隆 树莓中覆盆子酮与本亚甲基丙酮合酶基因克隆 材料与方法 讨论与展望 前言 结果与分析 一、前言 1.1树莓与覆盆子酮 树莓，又称称覆盆子，为悬钩子属，蔷薇科，半灌木，小桨果类。其红熟果称树莓果，是一种聚合果，有红色，金色和黑色，在欧美作为水果，在中国大量分布但少为人知，仅在东北地区有少量栽培 在自然界中，覆盆子酮广泛存在于悬钩子属植物树莓中，它是树莓香味的重要组分，香气清甜，属于具有果香味的暖香型香料。覆盆子酮是目前国内外大量使用的一种幽雅果香的香料。 一、前言 1.2 覆盆子酮的物理﹑化学性质 覆盆子酮，化学名为4-对羟基苯基-2-丁酮，其结构式为HO CH2CHCCH3O。常温下，为白色针状结晶，分子量164.20，熔点82-84℃，可溶于热水，易溶于乙醇等有机溶剂中。其分子结构中有酚羟基和酮基，因此能发生以下的化学反应：（1）羰基反应；（2）酚羟基反应；（3）芳环上反应。同时，由于各官能团的相互制约，存在一些特殊的性能。 一、前言 1.3 覆盆子酮的获取方法 天然提取法 化学合成法 生物合成法 一、前言 天然提取法 树莓果树资源有限，加之覆盆子酮在树莓果实中的含量极低，导致从植物中直接提取极不经济：运用最新的提取技术，每1000g树莓果实只能提取1-4mg覆盆子酮。资源的稀缺导致天然提取的覆盆子酮在国际市场售价高达2万美元/kg。 一、前言 化学合成法 苯酚与甲基乙烯基酮的合成路线 酚与丁醇酮的合成路线 对甲氧基苄基氯和乙酰乙酸乙酯的合成路线 对羟基苯甲醛与丙酮进行Claisen-Schmidt缩合，然后加氢还原的合成路线 一、前言 生物合成法 一、前言 BAS与CHS 查尔酮合酶（CHS）普遍存在于植物中。漫长的进化过程中，CHS基因在不同植物谱系中发生了不同程度的重复和分化，这些结构相似、功能相关、但表达模式及编码产物的催化特性有一定差异的基因组成了一个庞大的基因家族——植物查尔酮合酶基因超家族苯亚甲基丙酮合酶基因（BAS）属于该家族的一个成员。BAS使用与CHS相同的底物，但产物却存在很大差异。最近的研究结果显示，2个具有CHS和BAS活性的双功能酶——RiCHS和RiPKS4相继报道。 虽然可以证明在树莓中存在具有CHS和BAS活性的双功能酶基因，然而在基因序列信息、酶学特性及功能、基因特性（亚家族组成）和时空表达特性、基因功能及其遗传改良应用基础研究方面没有进行相关工作，亟需深入研究。 二、材料与方法 2.1 实验材料 植物材料：树莓材料取自中国科学院植物研究所。 菌株：大肠杆菌（Escherichia coli） DH5α为本实验室保存。 质粒：pMD18-T克隆载体购于大连Takara公司。 二、材料与方法 试剂： 植物总RNA提取试剂盒 (Autolabtech, Beijing, China)；TriZol试剂（Invitrogen, CA, USA）；ImProm-II™ 反转录试剂盒（Promega WI, USA）；胶回收试剂盒（Tiangen, China）；限制性内切酶、DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶购于大连Takara公司。 琼脂糖、Tris、EDTA、蛋白胨、酵母提取物、饱和酚、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（X-gal）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素等购自北京科创顺达生物公司；常规化学试剂均为国产分析纯试剂。 二、材料与方法 2.2实验方法 引物 碱基序列 RlBAS-UP 5-TATACATATGGCGGCTTCAATTGAGGAGATT-3 NdeⅠ RlBAS-DW 5-TATAGTCGACATGAATGATGGGCACGCTGCG-3 Sal I 二、材料与方法 创造一个无RNase的环境：实验台、离心机、移液器（架）等用75%乙醇擦拭；玻璃器皿常规洗净后，用0.1% DEPC水浸泡处理（37℃，2h），双蒸灭菌水漂洗几次，高压去除DEPC，150℃烘烤6h以上或120℃干烤过夜；塑料制品用0.1% DEPC水浸泡过夜（37℃），高压灭菌30min，70℃烘烤12h；溶液加DEPC至0.1%，室温处理过夜，或室温下磁力搅拌20min，然后高压处理30min。 二、材料与方法 Trizol 法 1) 称取100 mg植物新鲜幼嫩叶片，置于预冷的研钵中，加液氮研磨成细粉，分装于两个1.5 mL离心管中， 2) 每管加入1 mL Trizol提取液，混匀，室温下静置5 min； 3) 加入200 μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温下放置2-3 min； 4) 12,000 r/min离心15 mi