03细胞培养 第三章 培养用液.pptVIP

　　　 　　　　 第三章 培 养 用 液 培养用液是维护组织细胞生存、生长及进 行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶 液。 主要包括　平衡盐溶液 　　　　　　培养基 　 　　　　　　其他培养用液 　 　　第一节 水和平衡盐溶液 1、水：细胞培养用水必须非常纯净，不 　　　　　含有离子和其他的杂质。 　　需要用新鲜(一周内）的三蒸水或纯净水  2、平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS） 　组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的无机离子成分；用于洗涤组织、细胞等 几种常用的平衡盐溶液：主要由无机盐、葡萄糖组成 Ringer、PBS、Tyrode、Earle、Hank’s、D-Hank’s、Dulbecco（都有相应配方） 最简单的BSS是Ringer。D-Hank’s与Hank’s的一个主要区别在于前者不含有Ca2+、Mg2+ ，因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。 配制平衡盐溶液也应当用新鲜的三蒸水。配好的平衡盐溶液可以过滤除菌或高温高压灭菌。 有浑浊或沉淀时，应重新配制 PBS（Phosphate-Buffered Sallines） D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS) 　　　第二节 培养基 培养基就是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础 细胞培养基的基本要求: 体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、渗透压、pH等诸多方面的要求。 一、培养基中主要的成分包括 ： 1.氨基酸： 精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、 苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸和缬氨酸 （均为Ｌ型）。 2.碳水化合物：葡萄糖　　 3.维生素：叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、核黄素、硫胺素等。 4.无机离子与微量元素： 　 　　 二、培养基的分类： 1、天然培养基：即组织提取物和体液。 　　如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 　 2、合成培养基:需要添加血清培养细胞。 3、无血清培养基 　　不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 市场上可提供干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程比较繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便，但比较昂贵。 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等 三、如何选择培养基？ (1)建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。 (2)本实验室惯用的培养基 (3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基 (4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据试验结果选择最佳培养基 四、培养基的配制： （1）认真阅读说明书。 （2）配制时要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰 胺等物质都要在培养基完全溶解之后才能 添加。 （3）配制所用的水应为三蒸水，离子浓度很 低，水电阻达30万Ω以上。 （4）所用器皿应十分洁净。 （5）配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于 4℃。 　　　DMEM培养液的配制（举例） (溶解)900 mL ddH2O于1000 mL烧杯中，将DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。 （调PH）用5％－10％的NaHCO3调pH至7.2 （加抗生素）加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL （过滤除菌）用0.22um的滤膜过滤除菌。 （分装保存）分装（200 mL左右）后4℃冰箱保存。 　血清： 细胞在单纯的基础培养基中不能存活,基础培养基中常常要添加血清，添加血清后的培养基被称为“完全培养基”。 血清终浓度多为5％－20%。最常用的是10%。 广泛应用的血清种类有马血清与牛血清，后者又分为胎牛血清、新生牛血清与小牛血清。 胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新生牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10～30天的小牛 血清的主要作用 　(1)提供基本营养物质 　(2)提供贴壁和扩展因子 　(3)提供激素及各种生长因子 　(4)提供结合蛋白 　(5)对培养中的细胞提供某些保护作用 细胞培养中使用血清的缺点 (1)