[农学]第五、六章分子生物学研究法.ppt

　 5.2.1 核酸的凝胶电泳 (Agarose Polyacrylamide) 　 琼脂糖凝胶电泳 在琼脂糖凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 　 4. 焦磷酸测序法 (Pyrosequencing ) 适用于已知序列的DNA片段进行验证分析； 四种酶：DNA聚合酶、硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶； 三种原始底物：四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一、APS、荧光素。 dATP也是荧光素酶的底物，所以用dATPs代替，后者只是DNA聚合酶的底物。 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH) 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记（如生物素），然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 6.1.4 基因定点突变(site-directed mutagenesis) 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 寡核苷酸介导的 DNA 突变技术 重叠延伸介导的定点诱变 6.2 基因敲除技术 6. 2. 1 基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性； 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 条件型基因敲除 6. 2. 2 高等动物基因敲除技术 高等动物基因敲除的技术路线主要包括构建 重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用 基因捕获 6. 2. 3 植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。 5.3.5 基因文库的筛选 通过某种特殊方法从基因文库中 鉴定处含有所需重组DNA分子 的特定克隆的过程 常用方法：核酸杂交法，PCR筛选法和 免疫筛选法 P176 5.4 SNP的理论与应用 第一代分子标记——RFLP 第二代分子标记——SSR为代表的PCR基础的标记 SNP 5.4.1 SNP概述 转换 C←→T，颠换C←→A； 发生频率极高，人类大约携带300-1000万个SNP位点； 单倍型SNP：位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点。 SNP分类 基因编码区SNP（cSNP） 变异率小，又分为同义cSNP和非同义cSNP 基因调控区SNP（pSNP） 基因间随机非编码区SNP（rSNP） 5.4.2 SNP的检测技术 基因芯片技术 待测基因样品经PCR扩增及荧光化学标记后与固定的探针进行杂交； 目标基因和探针的杂交程度决定了荧光强度及种类； 根据荧光强弱或荧光的种类检测处被检序列的碱基类别。 2. Taqman技术 3.分子信标（Molecular beacons） 5.3.4 SNP的应用 人类基因单体型图的绘制； 大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型，代表了一个人群中人与人之间的大部分多态性； 某些染色体区域可以有很多SNP位点，但是只用少数几个标签SNPs，就能够提供该区域内大多数的遗传多态性模式。 SNP与疾病易感基因的相关性分析； 当一个遗传标记的频率在患者中明显超过非患者时，就表明该标记可能与这种疾病相关。 指导用药与药物设计 SNP能够充分反应个体间的遗传差异，所以通过研究SN