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可促进VEGF持续释放类胶原微球的制备与特性研究 摘要：本次研究中，我们准备了组织工程中的可注射胶原以实现人类重组VEGF（血管肉皮生长因子）的可持续释放。胶原溶液在油质乳液条件下形成，同时与碳化二亚胺实现交联。通过控制转速与表面活性剂浓度可形成各种在1-30um直径下的胶原微球。颗粒直径随转速增加比例下降（在300－1200rmp下，每增加100转降低1.8um）.在置有磷酸盐的培养基中，胶原微球表现8.86－3.15mv的轻微正电荷。研究结果显示，rh VEGF持续释放过程延续了4周。释放的VEGF可诱导人脐静脉内皮细胞中毛细管的形成，且释放后维持一段时间的生物活性。所以，我们得出结论，胶原微球可促进VEGF的持续释放。 1 介绍 最近有研究报告显示血管生成术在组织工程中有所应用，尤其是大型组织的形成。VEGF是一种有效的血管生成分子，然而，机体内被管理的VEGF可在短时间内分解和清除，从而导致重复循环。基于上述原因，许多有利于VEGF持续传递的材料已被研究。胶原基质DDS(药物输送体系)引起了广泛关注，因为它的可注射性与传递多样性。 以胶原、明胶、白蛋白、透明质酸为代表的天然高分子聚合物已经在DDS中有所应用。相对于合成聚合物而言，它们有极好的生物相容性。尤其是胶原显示出更优异的生物相容性，因为它是细胞基质的主要组成成分，并且在生物界中扮演了非常重要的角色。尽管有如此优势，可注射性胶原在DDS的研究却少有突破。 本研究中，我们在水油混合乳液条件下准备了可注射性胶原，以便实现VEGF的可持续性释放。首先，我们研究了乳化混合中表面活性剂浓度和转速对微粒直径 的影响。其次，做了显微观察和表面电荷的的测算。另外，我们从胶原微球中评估了人类重组VEGF的持续释放。最后，我们对人脐静脉血管肉皮细胞中释放后的VEGF的生物活性进行了化验。这里，我们论证了形成1－30um微粒直径的胶原微球的制法以及描述了胶原微球在DDS中可作为一种有用材料。 2材料准备和方法 2.1 试剂 猪皮胶原蛋白、液状石蜡、山梨聚糖醇、可溶水的碳化二亚胺、rh VEGF、DMEF、FBS(胎牛血清)、VEGF ELISA kit 、NHDFS(人类正常皮肤纤维母细胞)、EGM-2 2.2胶原微球的制备 在50ml不同浓度（0－1.5%）液状石蜡中乳化10ml1%（W/V）的胶原溶液，室温下，用高速离心机在300－1200rhm(每分钟转速)离心5分钟，用1ml50%的碳化二亚胺交联，在乳液条件下不停搅拌1小时以形成微球。添加50ml50%的酒精以使微球与油相分离。以3500rhm高速离心5min后去除上清液。再加入50%酒精以同样转速和时间再次离心。去除上清液，添加磷酸盐水缓冲溶液，再次以3500rhm,5min,混合离心。如此三次，除去余下的酒精，在0.3%的表面活性剂浓度，600rhm条件下，进行胶原微球中VEGF的注入，界面电动势，显微观察。 2.3胶原微球中VEGF的注入 4摄氏度条件，磷酸盐水缓冲溶液中浸泡1ug/ml的rh VEGF以及胶原微球24小时，装载了rh VEGF的胶原微球在3500rhm条件下离心5min后去除上清液，再加入PBS(磷酸盐水缓冲液)混合微球并以同样转速、时间离心。此过程持续三次后去除多余的rh VEGF. 2.4颗粒大小 通过手数法测出胶原微球颗粒直径，在PBS中搅拌胶原微球一昼夜以使微粒均匀分散。用显微镜对胶原微球取相，人工手数法最少要500颗微球才能测算出微粒直径。 2.5黏度 用黏度计在不同温度下测量液状石蜡和胶原溶液的黏度。 2.6电动电势 用Zetasizer通过测量电泳迁移率得出胶原微球表面电荷，此测量在PBS和EGM中进行以满足电动电势的溶剂依赖性。用Smoluchowsky模型计算电动电势的电流淌度。所有测量在25摄氏条件下进行3次。 2.7显微观察 胶原微球由2.5%的戊二醛固定并被酒精和醋酸异戊醛脱水。随后冷冻干燥样本，然后用金属离子溅射镀膜仪涂上Pt(铂金)后以扫描电子显微镜进行扫描，工作电压为20KV. 2.8 SDS聚丙烯酰胺 明胶电泳（SDS） SDS用XV pantera系统形成。分享凝胶的浓度为5%。胶原微球与ph=3的稀盐酸稀释到浓度为10mg/ml.胶原及明胶分别被ph=3的稀盐酸稀释至0.1%及1%。样品与0.1M的盐酸酸化的三异丙基乙磺酰（ph=6.8,由69.3mM SDS,40%的甘油，0.7mM的蓝色溴苯酚）混合，在99摄氏度条件下加热5min.电泳后，用考马斯亮兰R250对明胶染色。 2.9体外释放研究 把装载了胶原微球（100mg）的rh VEGF置入 insert wells,400ul的溶剂添加到lower wells.在PBS中浸泡的胶原溶液和EGM作为溶