[工学]第13讲-分子生物学方法1.pptVIP

从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 ;基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。 ;5. 1 重组DNA技术发展史上的重大事件;限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 ; 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。 具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。 获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。 ;5. 2 DNA操作技术;基本原理;琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2_50kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。 在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量 DNA，也可以被清晰地检测出来。 ;DNA电泳结果;5. 2. 2 核酸的分子杂交;5. 2. 3 细菌转化;5. 2. 4 核苷酸序列分析;2）Maxam-Gilbert化学修饰法： 用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，特异性切割碱基，产生一组各种不同长度的DNA片段的混合物，经电泳分离和放射自显影之后，根据X光片上所显现的相应谱带，判定DNA序列。 在碱性的条件下，肼（hydrazine，又叫联氨，NH2·NH2）能够从C4和/或C6原子位置作用于胸腺嘧啶和胞嘧啶碱基，环化形成新的5原子环。有六氢吡啶（piperidine）存在时，通过β-消除反应，释放2个磷酸分子并在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。 如果加入1mol/L浓度的盐，那么联氨同胸腺嘧啶的反应速率便会明显下降，发生胞嘧啶特异的化学切割反应。;硫酸二甲酯是一种碱性的化学试剂，能使DNA碱基环中的氮原子发生甲基化反应。 在中性pH条件下，鸟嘌呤和腺嘌呤残基上的甲基化足以导致配糖键发生水解，DNA链断裂。 加入六氢吡啶后，就只在G而不是A残基上发生DNA链的断裂。 在酸性环境中，因嘌呤碱基的质子化作用（protonation）导致脱嘌呤效应，会使配糖键发生水解，再经过六氢吡啶催化的β-消除作用移去磷酸分子，于是就会在这个位点上发生DNA链的断裂。这一反应是嘌呤碱基特异的。 ;3）DNA序列分析的自动化 包括两个方面：即“分析反应”的自动化和“读片过程”的自动化，后者是问题的关键。 现在大多采用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作为荧光剂，预先标记引物DNA。带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光，从而取代同位素标记。 在电泳凝胶的侧面，固定一个激光通道小孔，在凝胶板的上面装荧光信号接收器。当DNA条带在电场的作用下经过激光通道小孔时，带有荧光剂标记的DNA受激发产生荧光。荧光感受器收到荧光信号后，转换数据，判定核酸序列。 ;4）DNA杂交测序法（SBH，sequencing by hybridization）。 它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。 DNA杂交测序法，没有繁琐的凝胶电泳，不需要核酸酶，不需要进行复杂的化学反应，十分适合于大规模DNA序列分析。 ; DNA杂交测序包括两个步骤： 将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交。 与能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列