PCR技术原理与过程.pptVIP

PCR技术——聚合酶链式反应技术 韩立敏 2010.7 一、PCR技术原理 在有DNA单链、与DNA单链互补的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用下即可进行DNA单链5‘-3’合成反应。通过特殊的仪器不断满足上述条件，则DNA单链的5‘-3’合成反应可不断进行下去，直到条件不复存在。实际上是模拟天然DNA复制过程。 （一）PCR技术的基本过程 三步曲：变性、退火、延伸?? 1.变性：双链DNA解链成为单链DNA?? 2.退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 3.延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段 （二）平台期与平台效应 PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的对数累计趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程为平台效应。 二、PCR反应体系 缓冲液 模板 dNTP 耐热的DNA聚合酶 引物 三、PCR结果分析 四、PCR技术的应用 反转录PCR 锚定PCR 反向PCR 多重PCR 实时荧光定量PCR 不对称PCR、巢式PCR、长距离PCR等 （一）反转录PCR （二）锚定PCR （三）反向PCR （四）多重PCR  使用Taq DNA聚合（A组）酶或Platinum Taq DNA聚合酶（B组），利用5个不同的引物对，从人基因组DNA对dystrophin基因进行多重PCR。使用所示引物和模板浓度，从人基因组DNA中得到268bp到547bp范围的扩增产物。  （五）实时荧光定量PCR PCR技术应用实例——a-地中海贫血的诊断 * * * * * PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。 PCR反应过程示意图 Reaction Condition for a Typical PCR Assay Typical PCR Thermal Profile *This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length 对于多重PCR，Platinum? Taq DNA聚合酶提供了更好的灵敏度 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 海洋性贫血又称地中海贫血（Thalassemia）。是一组遗传性溶血性贫血。其共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋 白肽链有一种或几种合成减少或不能合成。导致血红蛋白的组成成分改变，本组疾病的临床症状轻重不一，大多表现为慢性进行性溶血性贫血。