气相色谱法测定功能性低聚糖.docVIP

PAGE PAGE 104 气相色谱法测定功能性低聚糖 项目完成单位：国家生物医学分析中心 项目完成人：郑永红 杨松成 魏开华 功能性低聚糖是指对人、动物具有特殊生理作用的单糖数在2?10之间的一类寡糖，它的甜度一般只有蔗糖的30?50%，具有低热量、抗龋齿、防治糖尿病、改善肠道菌落结构等生理作用。它是当今食品科学与工程研究领域的前沿，被誉为“21世纪食品工业的先导”。 目前，功能性低聚糖已被大量地用于各种医药制剂、口服液、保健品和含流汁病人的能源，主要包括大豆低聚糖、根霉低聚糖、麦芽低聚糖和低聚果糖等。如大豆低聚糖是从大豆蛋白质的水溶液中提取，主要成分是水苏糖、棉籽糖和蔗糖等寡糖，在生产大豆蛋白所排出的大豆乳清中其含量较高，而我国企业一直把它当废气物弃之，不但浪费资源，而且对环境造成严重污染。通过对大豆低聚糖的测定分析，可合理利用资源、降低成本。目前，日本已开发大豆低聚糖，将其列为“特殊健康用途的基料”。 大豆低聚糖是大豆中低分子量糖类的总称,其主要成分是水苏糖、棉子糖和蔗糖等寡糖。其中蔗糖是由α-D -葡萄糖和β-D- 果糖以α-1，2糖苷键结合而成;而棉子糖和水苏糖则是在蔗糖结构中的葡萄糖之Ｃ6位以α-1，6糖苷键又分别结合了一分子和二分子的半乳糖,均属非还原糖,其化学结构见下图。因人体消化系统中不存在α-1，6糖苷键的酶,大豆低聚糖不能被人体消化吸收和利用。大豆低聚糖有类似于蔗糖的甜味,甜度为蔗糖70%,热值为蔗糖50%,发热量为2卡/克,大豆低聚糖可以替代蔗糖作为低热能量甜味剂。 在功能性低聚糖的生产过程中，因产品及加工方式的不同，其含量和成分也会发生不同程度的变化，因此对于医药企业而言，建立一套操作简单、测定速度快、准确性高的检测方法，对于指导生产至关重要。本文进行了这方面的研究，取得了满意的结果。 实验部分 仪器与试剂 （1）气相色谱仪：美国惠普公司HP5890型气相色谱仪，HP3396A数据处理机。 （2）糖标准品：蔗糖、水苏糖、棉籽糖均购于美国Sigma公司。 （3）试剂：二甲基亚砜、六甲基二硅氨烷、三甲基氯硅烷、环己烷、肌醇（内标物），均为分析纯试剂。 （4）大豆低聚糖粗品：购于上海交大昂立股份有限公司。 1.2 样品制备 1.2.1大豆低聚糖的分离和纯化　 粗品用石油醚脱脂,80%乙醇脱单糖,热水浸提低聚糖,乙醇沉淀,干燥后经Savag法脱游离蛋白,20%H2O2脱色,透析脱盐,浓缩后取样上DEAE纤维素柱,依次用水、0.05mol/LNaCl和0.5mol/LNaCl洗脱,分部收集。透析脱盐,浓缩后冷冻干燥得到精制的大豆低聚糖。 1.2.2衍生化方法 由单因素影响试验得出适宜的衍生化-萃取条件为：称取1.0g精制品和0.15g肌醇，于磨口三角瓶中，加20mL水，置于60℃水浴提取1h，冷却过滤后，滤液缩干燥，加入2.0mL二甲基亚砜，使其溶解后，加入10mL环己烷萃取；加入1.0mL衍生化试剂（六基二硅氨烷：三甲基氯硅烷=2：1），振荡10min，静止50min，取1?L上清液进行气相色谱测定。空白样品处理同上。 1.3标准曲线的绘制 称取蔗糖、水苏糖、棉籽糖和肌醇(内标)约300mg于50mL容量瓶中，加水定容到刻度，作为标准溶液。将标准溶液稀释成一系列浓度，按样品处理方法，经衍生化后，备色谱测定用。取每种上清液进样3次，每次1ul。以各糖类物质的浓度与内标的浓度比作为横坐标，各糖类物质的峰面积（水苏糖和棉籽糖为二个峰面积之和）与内标峰面积比作为纵坐标，得出各糖类物质的内标法工作曲线。各工作曲线的r2均大于0.99，蔗糖、水苏糖、棉籽糖的线性范围分别为4.2～42mg/L,6.4～64 mg/L和5.6～56mg/L。将标准溶液稀释一定倍数,以S/N=2计, 蔗糖、水苏糖、棉籽糖的最小检测浓度分别为14μg/L、21μg/L、19μg/L。 1.4气相色谱条件 色谱柱HP-1(GcosslinkedMethylSiloxane),30m×0.32mm×0.25μm；氢火焰离子化检测器(FID),以高纯氮为载气(流速20ml/min),检测器和进样口的温度均为280℃,升温程序如下:150℃保持4min，以10℃/min速度，升温至160℃保持8min，以5℃/min速度，升温至180℃保持2min，再以20℃/min速度，升温至250℃保持5min；内标选用肌醇；分流比为50：1，分流进样，进样量为1?L。所得色谱图见图1，溶剂峰约在3min出。 图1 大豆低聚糖衍生物的色谱图 1-肌醇； 2-蔗糖；3，6-水苏糖； 4，5-棉籽糖 2 实验结果 2.1方法的回收率 回收率试验采取实际样品添加标样的方法测定，取3份平行样分别加入一定量的蔗糖、棉籽糖和水苏糖标准品，与1份