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微生物发酵工程案例教学 PAGE 2 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）产酒菌株在不同浓度氮源的合成培养基上的硫化氢和其他芳香化合物的产量 （周健平） 摘要：这个研究的目的是估计在酒精发酵过程中最初含氮量对硫化氢和其他挥发性化合物的产量的综合作用。基于这个提议，三个商业化的酿酒酵母的产酒菌株被用于不同氮含量条件下的葡萄汁合成培养基的发酵。硫化氢在发酵过程中进行测定，其他芳香化合物在实验结束后进行分析。培养基中最初的氮源含量与硫化氢总产量具有负相关关系，三个被测菌株的触发水平有所不同。对于UCD522 和 PYCC4072，硫化氢的最高产量出现在培养基中初始氮源含量为267mgN /l时，而最低水平出现在氮短缺/饥饿状态（66 mg N/l）。此外，属于不同化学类别的21种其他芳香化合物通过固相微萃取技术并结合气象液相色谱联用技术被认定并定量分析。初始氮源含量比不同酵母菌株对最终芳香化合物的产量更有决定性的作用，说明营养物质是调节风味物质产量的期望值的有效工具。 关键词：酵母，氮源，硫化氢，酿酒，芳香化合物 引言 硫化氢产量是酿酒业关注的主要问题，因为硫化氢的臭鸡蛋气味在非常低的浓度也会对酒的感官品质有深远的负面作用。在酿酒酵母中，硫化氢是硫酸盐还原途径的产物，是含硫氨基酸生物合成的中间产物。含硫氨基酸的生物合成需要来源于细胞内氮总量的含氮的碳前体和来源于硫酸盐还原途径的硫化物。因此，硫化氢含量的比率似乎由细胞对含硫氨基酸的需求和细胞内总氮含量的维持所控制。在产酒的情况下，硫化氢的产量与几个环境和营养因素有关，也就是基本含硫量中天然的硫化物含量的平均浓度水平（200mg/l），提前添加到葡萄中来进行酒精发酵的二氧化硫形式的硫（50–200 mg/l），含硫有机化合物的存在，以及维生素的短缺。然而，有报道称，硫化氢的含量与可同化的氮源之间的关系不密切。然而，氮源以及前面所提到的哪些因素的作用很大程度上取决于酵母的遗传背景，这给设计策略减少酿酒过程中硫化氢的产生带来了困难。 人们普遍认同酵母菌的种类和同化氮源的能力在决定酒的感官特征上扮演了重要的角色。有机酸、高级醇、乙醛、酮类和含硫化合物被认为是酒的最重要的感官组成部分，构成了“发酵香”的主要化合物群体。一些有机酸足够易挥发而产生气味，如乙酸（酸味），丙酸（膻味），丁酸（变质奶酪味）。在酒中，只有乙酸的含量可以跨越感觉的门槛，它的产量似乎与初始氮源水平呈负相关关系。高级醇例如异戊醇、戊醇、异丁醇在发酵过程中由相似的生化反应作为α酮酸的脱羧反应的结果被生产，这些α酮酸是来源于氨基酸的转氨基作用（由亮氨酸产生的α酮异己酸，由缬氨酸产生的α酮异戊酸，由异亮氨酸产生的α酮β甲基戊酸）或者通过Ehrlich途径或糖酵解产生的。这些醇类，在发酵过程中与酸合成了乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸异戊酯（类似香蕉味）、己酸乙酯、辛酸乙酯（类似苹果味）、2-乙酸苯乙酯等酯类，对白酒、啤酒以及其他酒精饮料中令人愉快的水果芬芳做出了重要贡献。在较低的水平内，这些化合物对酒的感官香气的贡献错综复杂。然而，当他们的含量太高时，也被考虑是产生杂味的原因。在其他的因素中，氮源含量在发酵过程中通过控制Erhlich途径、脂肪酸和酯类的合成途径影响高级醇和酯类的形式。此外，值得注意的是，这些产生于发酵过程中的化合物的产量在酿酒酵母的同一菌种和同一菌株内仍有所不同。只有最近进行的几项研究测定了氮源对酒中所含芳香化合物的影响。因此，当前工作的目的就在于测定硫化氢的产量以及测定三个不同酿酒酵母菌株在氮源条件不同的高糖酒精发酵过程中挥发性芳香化合物组成的潜在差别。这样，我们研究了在葡萄汁合成培养基上生长的三个广泛使用的商业化酿酒酵母菌株，分批培养，模仿酿酒的条件，并将初始氮源浓度设定为66、267及402mgN/l。关于生长、发酵行为、挥发性化合物生产及其他影响酒的特性的酿酒学特征的知识对于筛选最合适的菌株来生产某种特定味道和风味的酒很有用。 材料和方法 菌株和维持条件 本实验中用到了三个酿酒酵母菌株。S.cerevisiae UCD522的提供者是Enology Culture Collection, Department of Viticulture and Enology,University of California, Davis, USA。S. cerevisiae PYCC4072最初分离于Fermivin的一个样品，这个样品由Rapidase从购自Portuguese Yeast Culture Collection(PYCC), New University of Lisbon, Portugal的工业酒精酵母中分离出来。商业菌株S. cerevisiae EC1118最为活性干酵母购