肠病毒疫苗基因(VP1)重组蛋白质之表现与抗体生成之研究.docVIP

PAGE PAGE 1 腸病毒疫苗基因(VP1)重組蛋白質之表現與抗體生成之研究 研究學生: 林彥綸、陳怡錚 指導老師: 王玉麒教授 薛如娟老師 一、研究動機 腸病毒71型在世界各地都曾爆發流行 (Blombert et al., 1974; Chonmitree et al., 1981; Kennett et al., 1974)，自一九九八年起，臺灣也有許多兒童罹患手口足病或是中樞神經系統疾病，其中更有超過八十起的死亡案例。經檢驗後發現，這些兒童患者的腦部組織或是體液中皆存在有腸病毒71型 (EV71) 的核酸及蛋白質分子，因而判斷EV71為這些病症的主要病源。 EV71是單股RNA病毒，屬微小RNA病毒科，腸內病毒屬，具有四種外鞘蛋白質，分別命名為VP1、VP2、VP3、VP4，其中與人體感染機制有關的蛋白質主要為VP1。目前，為方便研究進行，EV71的遺傳物質(RNA)已被反轉錄成DNA，並且完全定序，其中共包含7401對核酸分子，而VP1蛋白質的生成基因(VP1)乃位於其中的第2439至3329對(見後附錄)，共891個核酸對組成。而其生合成的蛋白質分子量則約為40 kDa。 由於EV71感染的初期症狀並不顯著，是故發展一套敏感的EV71診斷系統，將有利於感染初期的診斷及後續的治療工作。 二、研究目的 目前雖然已有數種EV71的檢定方法，但均相對耗時或步驟繁瑣，較不利於掌控病毒蔓延的時效性。VP1為EV71四種外鞘蛋白質之一，亦為造成EV71感染人體細胞的重要蛋白質。本研究希望能藉大腸桿菌表現生成VP1的重組蛋白質，並藉其建立一敏感、快速的腸病毒偵測系統，同時也希望用此重組蛋白質為抗原來生產可辨識該蛋白質的抗體，以利後續的研究使用。 三、實驗器材與藥品 器材 1. 電子秤 2. 酸鹼儀 3. 接種環 4. 震盪培養箱 5. 無菌操作台 6. 微量離心管 7. 離心機 8.. 光電比色儀 9.. 熱感應照相系統 10.. 垂直、水平電泳槽 PAGE 1 PAGE 9 藥品 1. TAE buffer: 10 mM Tris-acetate，1 mM EDTA，pH 8.0 LB培養液: 1% (w/v) Bacto trypton，0.5%(w/v) yeast extract，1% (w/v) 3. NaCl，pH 7.0 6X loading buffer: 0.25% (w/v) bromophenol blue，0.25% (w/v) xylenl 4. cyanol，30% (v/v) glycerol SDS sample buffer: 62.5 mM Tris-Cl ，pH 6.8 ，2% (w/v) SDS，5% (v/v) 1. 2-mercaptoetheanol，10% (v/v) glycerol，0.25% (v/v) bromophenol blue SDS running buffer:25 mM Tris，192 mM glycine，0.1% (w/v) SDS，pH 8.3 Coomassie Blue染劑: 0.25% (w/v) Coomassie blue R，50% (w/v) 0. methanol，10% (v/v) acetic acid 7. 一級退染液: 50% (v/v) methanol，10% (v/v) acetic acid 8. 二級退染液: 5% (v/v) methanol，7% (v/v) acetic acid 12% Separating gel (for 30 ml): 10.1 ml H2O，7.5 ml 1.5 M Tris-Cl，pH 8.8，0.3 ml 10% (w/v) SDS，12 ml (w/v) 30% acrylamide，150 μl 20% (w/v) ammonium persulfate，15 μl TEMED 4% Staking gel (for 20 ml): 12.2 ml H2O，5 ml 0.5 M Tris-Cl，pH 6.4，2.7 ml 10% (w/v) SDS，100 μl 30% (w/v) acrylamide，100 μl 20% (w/v) a