植物染色体显微切割技术的研究现状与展望-遗传.PDFVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)19(2):45一471997 植物染色体显微切割技术的研究现状与展望 马有志 徐琼芳 辛志勇 （中国农业科学院作物育种栽培研究所，北京 100081) TheAdvancesoftheTechniqueofPlantChromosomeMicrodissection MaYouzhiXuQiongfang XinZhiyong (heInstituteofCropBreedingandCultivation,CAAS,Beijing100081） 染色体显微切割技术是指在显微镜下对特定染色体进行显微切割、分离，随后进行DNA扩增、以构建特定 染色体或染色体区段的特异性DNA文库 其优点是根据研究者的需求，可以获得任意一条染色体或染色体任意 区段的DNA标记。它是随着近 10年来分子生物学技术的发展而诞生的一项高新技术，将成为基因定位、基因 克隆的有力武器，将开辟细胞遗传学又一新的研究领域。本文综述了该技术的产生、发展及今后的应用前景。 1染色体显微切割技术的产生和应用 染色体显微切割技术是80年代初期诞生的。1981年，Scalenghe110〕首次报道了应用特殊的玻璃针对果蝇的 唾液腺染色体进行切割、分离和显微克隆。由于当时还没有出现DNA扩增技术，为获得足够量的DNA，就要切 割收集 ！00-200条染色体。因为该技术操作复杂，不容易掌握、要获得如此数目的染色体是比较困难的 因而，该 技术在当时没有得到迅速推广和应用。1985年诞生了PCRDNA扩增技术，特别是 1988年由于发现了耐热性 DNA聚合酶，使PCR技术实现了自动化，从此，PCR技术渗透到生命科学的各个研究领域。Ludecke等 8〔，将 PCR技术应用到染色体显微切割，用少量的切割片段成功地扩增到足够量的DNA产物。Jinno等人6〔〕开发出连 接引物PCR技术(L（inkageprimerPCR)．用于扩增酶切后的染色体片段；Hadan。等人 ”〔提出SUP-PCR法，可 直接对切割分离到的染色体或染色体片段进行PCR扩增。由于PCR技术的不断改进，使切割产物能有效地得 到扩增 。 另外，除用玻璃针法对染色体实施显微切割之外，日本农林水产省北陆农业试验场的福井希一等 4〔，报道了应 用美国Meridian公司开发的激光共聚焦扫描显微镜(C（ellWorkStation,ACAS470型）对水稻、大麦染色体进行 显微切割分离。该显微操作装置可发射波长为350--528nm的激光，并且，通过控制系统可对激光的照射强度、 时间、位置进行调控，解决了玻璃针切割法操作困难、不容易掌握的技术难题，使染色体显微切割技术逐渐趋向 简单化 自1989年以来，染色体的显微切割技术的研究成果主要是在人类染色体区带特异性探针池的构建方面 采用 玻璃针法已相继构建了一些人类染色体区带探针池 ’〔·’）“。植物染色体的显微切割技术的应用研究起步较晚，目 前尚无较大进展。Jung等人7〔〕应用玻璃针切割技术构建了野生甜菜B（etapatellaris）特定染色体的基因文库。他 们从4个花粉母细胞中分离出靶染色体，经酶解、连接、转化等步骤获得了23000个重组DNA，其中52％是单 拷贝或低拷则勺，18%是野生甜菜染色体特异性DNA片段。Schondelmaie：等人C11〕应用类似的方法构建了大 麦 1HS染色体的DNA文库。他们得到44000个重组DNA，其中13% (5600个）的重组DNA可用于进行 RFLP分析。福井希一等 a〔〕报道了应用激光切割技术对水稻和大麦染色体进行显微切割。富田因则等人 ’〔）应 用激光切割技术获得黑麦染色体的特异性DNA片段。研究表明二应用染色体显微切割技术构建特定染色体或染 46 遗 传 HEREDITAS(Beijing)1997 19卷 色体片段的DNA文库，有助于筛选特定染色体的分子标记，增大特定染色体的RFLP图谱密度。我国目前还 没有植物染色体显微切割方面的报道。 2染色体显微切割技术的实验流程 2.1染色体标本的制作与染色体的识别鉴定 采用玻璃针切割法时，染色体标本的制作一般用通常的玻璃载片即可．采用激光切割时染色体标本要求在一 个底部枯贴有特殊薄膜的培养皿上制作．染色体标本制作应尽量避免不必要的