激光共聚焦扫描显微镜技术-中国显微图像网.PDFVIP

三院消化科：冷玉心鑫 2004 直博 电话e-mail:lengyuxin1980@ 激光共聚焦扫描显微镜技术 摘要：激光共聚焦扫描显微镜在普通光镜基础上引入共聚焦装置，该装置能够排除非焦平面 及焦平面非焦点光斑信息，大大提高分辨率和图象清晰度。在此基础上，由于计算机及相应 的软件技术组合，可以对较厚样品进行连续光学切片及三维重建。目前，激光共聚焦显微镜 （LSCM ）技术已广泛应用于生物医学领域。本文对 LSCM 的应用原理、较普通光镜的优点 及生物学应用做简单介绍。 激光共聚焦扫描显微镜是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科 技产品。其组成除光学显微镜部分之外主要由激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统 （包 括数据采集，处理，转换，应用软件）、图象输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。在生 物医学等研究领域中发挥重要作用，尤其在研究和分析活细胞结构、分子、离子的实时动态 变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维重建等方面，是传统的光学显微镜所望尘莫及 的。 一: LSCM的主要组成部分及工作原理： 图 1 图2 illuminating pinhole:照明针孔 功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高 度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。且与detector pinhole(探测器针孔) 及焦平面形成共聚焦装置。 beamsplitter:光束分离器 功能：将样品激发荧光与其他非信号光线分开。 Objective:物镜 1 三院消化科：冷玉心鑫 2004 直博 电话e-mail:lengyuxin1980@ Focal plane:焦平面 功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。 该光斑经过obje ctive,beamsplitter等一系列装置的处理，分别在illuminating pinhole及 detector pinhole两处聚焦。共聚焦的含义由此而来。 detector pinhole :探测器针孔 功能：与beamsplitter作用类似，起到空间滤波器的作用。最大限度的阻碍非聚焦平面散射光 和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光，以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样 品光斑焦点位置，因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息（两点共 轭）。 PMT ：光电倍增管（探测器） 功能：接受通过针孔的光信号，转变为电信号传输至计算机，在屏幕上出现清晰的整幅焦平 面的图象。 激光器：图中未示。共聚焦显微镜技术的发展离不开激光器的飞速发展。我们可以根据研究 需要选择不同的激光器。如 ArUV(351.364nm),HeCd(442nm),AR(457,488,514nm),ArKr(488,568,647nm)Kr(568nm),HeNe(5 43nm),HeNe(633nm)等。 多荧光通道：具有多个荧光通道，以实现同时对样品进行多种标记。 经过对LSCM 的各组成部分了解之后，其工作原理不难理解。即：点光源照射样品产生 的激发光斑被探测器以共扼的形式接收于焦平面，计算机以像点的方式将被探测点显示在计 算机屏幕上。为产生一幅完整图象，可通过计算机控制的步动电动机带动显微镜移动，以实 现在同一焦平面上的逐点扫描。同样，也可以通过沿Z轴方向逐渐改变焦平面，来完成对样 品不同层面的扫描。亦即可对细胞或组织厚片进行类似CT断层扫描的无损伤连续光学切片， 连续光学切片经过计算机三维重建的处理，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结 构。 （ ） 二：LSCM相对光学显微镜的优点 1~10 ： （1）：LSCM 的图象是以电信号的形式记录下来的，所以可以采用各种模拟的和数字的电子 技术进行图象处理：（2 ）LSCM利用共聚焦系统有效的排除了焦点以外的光信号干扰，提高 了分辨率，显著改善了视野的广度和深度，使无损伤的光学切片成为可能，达到了三维空间 定位；（3 ）由于LSCM能随时采集和记录检测信号，为生命科学开拓了一条观察活细胞结构 及特定分子、离子生物学变化的新途径：（4 ）LSC