蛋白质的提取与分离2012-3-10.ppt

你能说出多少种富含蛋白质的食品？ 蛋白质在细胞中的含量仅比水少，约占细胞干重的50% 参与生理功能的调节  有关蛋白质的知识你知道哪些？ 免疫作用  蛋白质是人体的建筑材料 、提供能量等 要研究某种蛋白质的结构和功能，往往要先对蛋白质进行提取和分离 如何提取和分离蛋白质呢？ LDH同工酶：由H、M亚基按不同比例组成的四聚体；五种类型： H4（LDH1）； H3M（LDH2）； H2M2（LDH3）； HM3（LDH4）；M4（LDH5） 每个亚基分子量35000，酶分子量140000 实验 乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离 实验 乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离 一、实验原理 蛋白质在立体网状的琼脂糖凝胶中电泳时，迁移速度主要取决于它所带电荷、分子大小和形状等因素。因此具有不同电荷、分子大小和形状的乳酸脱氢酶同工酶可以通过琼脂糖凝胶电泳分开 * 蛋白质在电泳中的分离因素 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同 电荷因素 分子大小 分子形状 二、实验材料 动物的心脏（肝脏、血液、骨骼肌、肾脏） 冰块、琼脂糖、0.05mol/L磷酸提取缓冲液 （PH=7.4)、 TBE电泳缓冲液、乳酸脱氢酶同工酶染色液、离心机、水平电泳槽等 三、方法步骤 实验录像 三、方法步骤 ?心脏(5g)+磷酸提取液(25ml) 1 .乳酸脱氢酶同工酶的提取 在冰浴中 研磨成匀浆 ?匀浆离心 4℃ 12000rpm 10min 上清液 4℃保存备用 三、方法步骤 2 .乳酸脱氢酶同工酶的琼脂糖凝胶电泳 ?制胶 TBE电泳缓冲液+1%琼脂糖 加热溶解后 凝胶板 倒胶板，插梳子 ?加样、电泳 同工酶提取液+载体缓冲液 混匀 取20ul加入样品孔 电泳 100V 30min 三、方法步骤 3 .乳酸脱氢酶同工酶的显色 电泳完后，取出胶板浸入染色液中37℃染色15min,取出水洗，观察结果 紫色深浅正比于LDH同工酶活力，因此可用于鉴定LDH 同工酶的种类和测定LDH同工酶活力。 提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 凝胶色谱法 ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、什么是凝胶？ 2、什么是凝胶色谱法？ 学生活动2: 3、凝胶色谱法的原理是什么？ 4、请用自己的话总结出凝胶色谱法分离相对分子质量不同蛋白质的具体过程。 ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 4、具体过程 相对分子质量较小 较长 较慢 相对分子质量较大 凝胶外部 较短 较快 * *