植物基因组DNA的提取课件.ppt

3、方法与步骤 ③ 移入经过预冷的研钵中，加入液氮研钵至粉末状，用干净的灭菌不锈钢药匙快速转移粉末至1.5mL离心管中；加入250μL的CTAB提取液，总体积达到500μL，混匀后置65 ℃磁力搅拌水浴锅中保温60min； ④ 加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），轻轻地颠倒混匀，室温下12000rpm离心10min，移至上清至新1.5mL EP管；（可重复④ ，抽提两次） * 3、方法与步骤 ⑤ 加入1倍体积的冰异丙醇或者2倍体积冰无水乙醇，颠倒混匀，冰浴1h，或者-20 ℃放置30min，或-80 ℃放置10min； ⑥ 室温下12000rpm离心10min（可离心时间长一些）； ⑦ 弃上清，用70%冰乙醇清洗沉淀两次； ⑧ 室温晾干约20~30min； ⑨ 加入100μL TE 缓冲液，加入2μL RNase，37 ℃放置30min，或者室温放置1h； ⑩ -20 ℃保存。 * 4、注意事项 CTAB在低于15 ℃时溶于沉淀，所以使用之前要65 ℃时预热，用前再加巯基乙醇或者加入亚精胺（100μL DNA加5μL 0.1M的亚精胺）； 在研磨前，研钵里不得有任何水分，否则加液氮时容易结冰； 在用不锈钢灭菌后的药匙移取粉末时，可用枪头的大头移取； * 4、注意事项 在加入氯仿-异戊醇抽提离心后，拿出离心管时动作要轻缓，吸取上层溶液时所用的枪头要减去下面尖端部分，吸取时不要吸取中间的蛋白质层； 用70%的乙醇洗DNA后，要使乙醇完全挥发，否则会对后续的PCR产生影响，甚至对限制性酶作用产生非特异性； * 4、注意事项 最后溶于TE缓冲液中： 在无离子水溶液中，低浓度的核酸由于磷酸基负电荷的排斥作用会引起变性。 * * 星星活性 星星活性（star activity）： 在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。 影响星星活性的因素有很多： 甘油浓度高（5%），酶过量（100U/μL）,离子强度低（25mM），pH过高（8.0），或者加入了有机溶剂DMSO（二甲基亚砜），乙醇，乙二醇，或者用其他二价离子如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+代替了Mg2+。 * 4、参考文献 [1] 钟卫鸿.基因工程技术实验指导[M].北京： 化学工业出版社，2007，7. [2] 王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学教程[M].北京：高等教育出版社，2008，6. [3] 孙明.基因工程[M].北京:高等教育出版社，2006，5. [4] 彭学贤.植物分子生物技术应用手册[M].北京：化学工业出版社，2006，2. * * 植物基因组DNA的提取 * 植物基因组DNA的提取 1、实验原理 2、材料、仪器、试剂 3、方法与步骤 4、注意事项 5、参考文献 * 植物基因组DNA的提取 植物基因组DNA提取的方法主要有： SDS法 CTAB法是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸，重要用途提取DNA和RNA。 * 1、实验原理 SDS、CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白（DNP）解聚，从而使DNA得以游离出来。 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入冰无水乙醇或者异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 * * CTAB法 CTAB法，是1980年Murray和Thompson修改而成的快速简便提取植物DNA的方法。 * CTAB法 十六烷基三甲基溴化铵 (cetyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)，为阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在高盐溶液（0.7mol/L NaCl）中可溶，当盐浓度降低到一定程度（0.3mol/L NaCl）时，可沉淀CTAB-核酸的复合物，通过有机溶剂抽提和离心沉淀即可除去蛋白质，多糖和酚等杂质。最后通过冰乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB因溶于冰乙醇或异丙醇而被除去。 * 2、材料、仪器、试剂 2.1 材料 水稻幼苗叶子 2.2 仪器 高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅、研钵、50mL离心管及1.5mL Eppendorf（EP）管、移液枪及枪头、药匙。 * 2、材料、仪器、试剂 2.3 试剂 CTAB提取液： 2%CTAB，100mM Tris-HCl（pH8.0），20mM EDTA（pH8.0），1.4M NaCl， 0.1%PVP（聚乙