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关于western blot原理和常见故障分析 关于western blot 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探 针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固 相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中 等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β- ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存， 用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收 集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。加入β-ME(9.5ml 加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取 出，直接溶解上样。 3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。 B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1.双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测 定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双 缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物， 此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液 测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀 法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已 知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。 2.Lowry法： 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱 性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结 果得到深蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋 白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他 物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试 剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福 林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试 剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。 3.紫外吸收法： 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨 酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。 如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白 质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。 4. Bradford比色法： Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋 白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的 干扰。 分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20μl），以 0.15mmol/l NaCl补足至100μl，同时以两管100μl的0.15mmol/l NaCl作空白对照。 每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。用1cm光径的微量 比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品 的A595。从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。测定10-100μg的蛋白质，要在较 大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100 μg另作一标准曲线进行测定。 5．电泳估算法（我们选择此法）： 样品倍比稀释，SDS电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。 以提取癌组织总蛋白为例： ① 取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷 的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。 ② 每2克组织加入3ml 1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。 ③ 加入5×STOP Buffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。再加入0.5ml β-ME， 0