绿色萤光蛋白质纯化试验GreenFluorescentProteinPurificationkit.PDFVIP

澳門科學技術協進會 綠色螢光蛋白質純化實驗 （Green Fluorescent Protein Purification kit ） 一、 介紹 在生物技術產業化過程中，當通過研究發現有用的蛋白質後，便希望得到這個蛋白質。 而在不同的生物體往往產生大量的不同種類的蛋白質，如何純化所需的蛋白質是現代生物技 術面臨的重要課題。層析是目前生物產業用於蛋白質純化的最通用的手段。本實驗通過層析 的方法純化綠色螢光蛋白，由於該蛋白質在紫外下發綠色螢光，學生可監測整個層析的過程。 二、 實驗基本原理 在成功轉化了綠色螢光蛋白基因的細菌中，通過溶菌酶（Lysozyme ）的作用和低溫過 程，可將細菌表達的不同蛋白裂解在溶液中。 利用不同蛋白與疏水柱結合程度不同，用層析的方法將綠色螢光蛋白與其他蛋白分離 開。 在高鹽濃度下，蛋白的疏水端露在 外。而在低鹽濃度下，蛋白的親水 端在外，而疏水端藏在裏面。 在高鹽濃度下，蛋白的疏水端露在 外。蛋白結合在柱子上。 經洗脫液洗滌後，綠色螢光蛋白由 於疏水性能強，仍結合在柱子上， 而其他蛋白由於疏水性能弱，被洗 脫。 用 TE 溶液（鹽濃度低），可將結合 在柱子上的綠色螢光蛋白溶解，並 用收集管收集。 1 澳門科學技術協進會 三、 實驗步驟： 1 ） 1．用紫外燈檢查在LB/amp/ara 板上的菌落 ，應該會發出綠色螢光 。 2 ．用吸液管吸取250 ul 的TE 溶液加入小管中。 3 ．使用接種環分別從平板中挑取單個菌落（單克隆），加在盛有 TE 溶液的小管中(轉動接 種環數次 ，使菌落能溶於溶液中) 。 4 ．加一滴溶菌酶消化細菌的細胞壁，用手指輕彈使反應充分。並加以冷凍，使細菌破裂。 2 ） 1．用手溫使小管解凍，離心10 分鐘，分離不能溶解的碎片。 2 ．在離心的時間裏，將純化柱的帽和尾打開，使其中的液體流乾 （約3 到5 分鐘）。 3 ．加入2 ml 平衡緩衝液(EBF)使純化柱平衡。在約還剩 1 ml 平衡緩衝液時加上柱“尾”備 用。 4 ．離心結束後，用紫外燈檢測，應該發現上清發出綠色螢光。將上清用吸液管吸出至另一 乾淨小管中。 5 ．用吸液管在上清中加入250 ul 上樣結合緩衝液(BBF) 。 3 ） 1．將三根試管分別標記上 1 、2 、3 。先選用1 號收集管。打開柱的尾部，使剩餘的平衡緩 衝液流至液面與柱內填料面相切。 2 ．此時使用一根新的吸液管，沿純化柱的內壁緩緩加入混合均勻的樣品液250 ul （發綠色 螢光的上清和結合緩衝液的混合液），同時用紫外燈監測。觀察綠色螢光蛋白在與純化 柱的結合。 3 ．換用2 號收集管，加入250 ul 清洗緩衝液(WBF) ，洗去未結合的雜質，同時用紫外燈觀 測。注意記錄所看到的螢光處於什麼位置。 4 ．用750 ul 的TE 緩衝液將綠色螢光蛋白從純化柱上洗脫，同時用紫外燈觀測，見有綠色 螢光蛋白下來的時候，換用3 號收集管收集純化好的綠色螢光蛋白。 5 ．在紫外燈的激發下觀察3 根試管中所收集物質的差異。 2 澳門科學技術協進會 6 ．思考題 1 ．請解釋以下儀器，試劑在實驗中的用途： a) 紫外（UV ）燈、b) 培養箱 、c) 冰浴、d) 溶菌酶 2 ．請解釋為什麼在這兩管培養液中都有綠色螢光蛋白的表達？ 3 ．請觀察每個純化實驗步驟中何處有綠色螢光，為什麼？ 是否觀察到綠色螢光蛋白 解釋原因 2.1 離心後 上清 沉澱 3.1 離心後 上清 沉澱 4.2 上樣後 柱子上 管