桑国俊牛卵母细胞体外培养技术研究教学课件.ppt

* * 桑国俊 甘肃省畜牧兽医研究所 一 发展背景 二 试验内容 三 结果与分析 四 总结 一 发展背景 随着胚胎工程技术的深入研究和商业性胚胎移植技术的发展，胚胎需求量日益增加，单纯依靠超数排卵获得体内胚的方法成本高、采胚数量有限，不能满足科研和生产的需要。卵母细胞体外胚生产体系的建立将成为胚胎生产的主要突破点。深入研究卵母细胞体外胚及其冷冻保存的技术机理，建立一套完全在体外培养条件下快速生产和保存胚胎的技术体系，挖掘优良母畜的繁殖潜力，具有巨大的科研价值与现实意义 牛胚胎体外生产技术的累积效率低、技术复杂、实验条件高，受培养基、卵泡液、共培养细胞等因素影响大，还缺乏统一的理论依据和程序化的标准方案，仍处于探索阶段。因此，还必须不断改进和完善胚胎体外培养和生产体系 二 试验内容 试验内容…技术路线 种公牛 鲜精 冻精 洗涤、离心 精子获能 母牛 超排 卵巢采卵 IVM IVF IVC 桑、囊胚 COCs 试验内容…试验设计 1 卵母细胞体外成熟培养 1.1 COCs级别对卵母细胞成熟的影响 1.2 卵泡直径对卵母细胞成熟的影响 2 卵母细胞体外受精 2.1 不同离心方法对精子获能和卵母细胞受精的影响 2.2 不同上浮方法对精子获能和卵母细胞受精的影响 2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响 3 胚胎体外培养 3.1 共培养体系对胚胎发育的影响 3.2 培养液体积对胚胎发育的影响 4 冷冻保存COCs的培养 4.1 GL和EG一步法冷冻对COCs的影响 4.2 麦管和OPS管玻璃化冷冻对COCs的影响 SPSS统计分析 三 结果与分析 从试验结果看，宜选用上清液15min组的获能精子进行体外受精。本试验突破了精子离心法的传统方法，避开了单纯利用沉淀液进行精子获能的思路，而直接对上清液进行离心处理，获得了理想的精子洗涤和获能效果 精子获能 活 力 超活化效果 2.2 不同温度上浮法对精子获能和卵母细胞受精的影响 室温上浮法： 20～24℃室温。上浮60min，45min活力最高0.68，对其获能15min后进行体外受精，平均受精率41.40% 室温上浮 精子活力 冻精 0.5000 g 上浮15min 0.5667 c 上浮20min 0.6200 b 上浮25min 0.5933 bc 上浮30min 0.6100 bc 上浮35min 0.5467 df 上浮40min 0.5900 bce 上浮45min 0.6800 a 上浮50min 0.6233 b 上浮55min 0.6033 bc 上浮60min 0.5267 de 恒温上浮法：CO2培养箱（38.5℃）上浮60min，30min活力最高0.697，对其获能15min体外受精，受精率41.51% 恒温上浮 精子活力 冻精活力 0.4800 d 上浮15min 0.5367 c 上浮20min 0.5933 b 上浮25min 0.6067 b 上浮30min 0.6967 a 上浮35min 0.5867 b 上浮40min 0.5300 c 上浮45min 0.4633 d 上浮50min 0.4367 d 上浮55min 0.4100 e 上浮60min 0.3867 e 二种不同上浮方法的精子活力和受精率之间差异不显著（p＞0.05），恒温上浮法的效果略高于室温组。室温随着季节和气候变化而变化，始终处于不稳定状态，精子活力升降比较零乱，而恒温上浮的条件稳定，精子活力升降序列比较整齐，在本试验中的优势虽不明显，如从可控角度考虑，还以恒温上浮法为宜 培养液表.xls 项目 受精率 上清液获能 精子受精率 43.21 沉淀液获能 精子受精率 40.18 室温上浮获能 精子受精率 41.40 恒温上浮获能 精子受精率 41.50 受精率 获能方法 与卵母细胞受精率 2.3 精子浓度对卵母细胞受精的影响 本试验表明精子适宜浓度宜控制在1.0～1.5×106个/ml 精子浓度 样本 COCs 卵裂 受精率 高（300万/ml） 30 402 137 33.9637 c 中（150万/ml） 30 403 190 47.3357 a 低（100万/ml） 30 382 162 42.3837 b 3 胚胎体外培养 3.1 卵丘细胞、卵丘细胞+bFF共培养系统对胚胎发育的影响 处理 样本 COCs 桑椹胚数 囊胚数 桑椹胚率 囊胚率 卵丘细胞组 30 391 113 33 29.0713 b 8.5063 b 卵丘细胞+bFF 30 242 148 45 34.9890 a 10.6343 a 对照组 30 308 78 19