EcoliT蛋白CM的原核表达及核磁方法指导下的晶体优化.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（９）：３８４４ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 Ｅ．ｃｏｌｉＴ蛋白ＣＭ的原核表达及核磁方法 指导下的晶体优化 芮　斌　谢长林　江　娜　文　汉 （安徽农业大学生命科学学院　合肥　２３００３６） 摘要　越来越多的研究表明许多致病菌的病原性与生物体内莽草酸途径中的分支酸变位酶 （ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅｍｕｔａｓｅ，ＣＭ）有着密切的关系，因此ＣＭ成为了开发新型抗生素和抗菌药物的热门靶 标酶。采用分子克隆的方法，在感受态细胞ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）中重组表达大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔ蛋 白的ＣＭ（ＣＭ）。通过ＮｉＮＴＡ亲和层析柱、ＧＥＳｕｐｅｒｄｅｘ７５凝胶过滤层析柱和 ＧＥＭｏｎｏＱ阳离子 Ｔ 交换层析柱纯化后得到电泳纯的重组蛋白，质谱鉴定结果与原始序列基本吻合。经过蛋白质晶 体试剂盒的初步筛选，在３０％ＰＥＧ４０００，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａＡｃｐＨ４．６，２００ｍｍｏｌ／ＬＮＨＡｃ条件中发现 ４ １ １５ ＣＭ 晶体。利用核磁共振方法，分析ＣＭ 的 ＨＮＨＳＱＣ谱图信息，指导设计ＣＭ 晶体的优化方 Ｔ Ｔ Ｔ 案，成功获得高衍射能力的ＣＭ 晶体，为ＣＭ 结构的解析奠定了坚实的基础。 Ｔ Ｔ 关键词　分支酸变位酶　ＣＭ　原核表达　ＨＳＱＣ　晶体优化 Ｔ 中图分类号　ＴＱ１３８ 　　莽草酸途径是生成芳香族氨基酸、泛醌、甲酸、维 羟基苯丙酮酸，是合成酪氨酸的重要步骤［４］。尽管在 生素Ｅ和维生素Ｋ等多种代谢产物的共同途径，在植 生物体内催化着同一反应，但 ＣＭ 与ＣＭ 同源性只有 Ｔ Ｐ 物和微生物的合成代谢中起着重要的作用。哺乳动物 ［５］ ３０％左右。ＣＭ 的结构已被Ｌｅｅ等 解析出来，包含３ Ｐ 的细胞中不存在莽草酸途径，其自身也无法合成芳香 个 螺旋，并且其酶活位点、催化机制和抑制分子都已 α ［１］ 族氨基酸 。分支酸变位酶（ｃｈｏｒｉｓｍａｔｅｍｕｔａｓｅ，ＣＭ） 经被揭示。作为功能相似的ＣＭ ，其结构特点，酶活位 Ｔ 是莽草酸途径中催化分支酸变构，使其走向苯丙氨酸 点以及催化机制如何，是否和ＣＭ 的一致，都有待于进 Ｐ （ ［２］ Ｐｈｅ）和酪氨酸（Ｔｙｒ）合成途径的重要功能酶 。许多 一步的研究和探索。而ＣＭ 的结构信息是解决这一问